雌激素受体基因单核苷酸多态性与复发性自然流产的关系

李可可 王 璐 党 洁 马占兵 陆 宏

复发性自然流产(recurrent spontaneous abortion，RSA)是指妊娠20周前重复发生3次或3次以上的自然流产，发生率约为1%～5%[1～3]。除了已知的致病因素(如染色体异常、自身免疫、内分泌、解剖等)外，目前尚有约50%的RSA病因未明[4]。临床实验与观察发现，妊娠的维持不仅取决于免疫平衡，还依赖于激素的支持。雌激素作为女性生殖系统最重要的性激素之一，其生理作用需由雌激素受体(estronge receptor, ER)来介导[5,6]。ER有ERα、ERβ两种亚型(estrogen receptor α、β)，分别由位于不同染色体上的雌激素受体α和β基因(estrogen receptor α、β gene，ERα、ERβ)编码。研究表明，ER基因(ERα、ERβ)的不同多态性位点(如ERα：rs2234693、rs9340799，ERβ：rs1256049、rs4986938等)可能会影响不同的雌激素依赖途径，从而与很多女性疾病(如子宫内膜异位症、子宫肌瘤、子宫内膜癌等)的发生有一定关联[7]。近年来，ER基因作为一种可能与RSA相关的候选基因，其上述4个多态性位点与RSA发病风险的相关性研究报道亦逐渐增多，但结果不尽一致[8～16]。本研究探究ER基因单核苷酸多态性与宁夏回族自治区汉族妇女RSA是否相关。

对象与方法

1.研究对象：选取2009年1月～2015年12月在宁夏医科大学总医院确诊的RSA患者95例为病例组，患者年龄20～34岁，平均年龄27.63±3.25岁；另选取同一时期在该院正常分娩，基本信息(民族、年龄等)与病例组相当的健康女性190例为对照组，年龄20～36岁，平均年龄27.37±2.50岁。病例组纳入标准：患者及配偶均无染色体异常，男方精液正常；无成功妊娠史，流产次数≥3胎且孕周均<20周；排除子宫等生殖器官畸形及感染等因素；无遗传病家族史；对照组纳入标准：经检查至少有1次成功妊娠史，排除有早产、自然流产、死胎及妊娠高血压等情况的个体。对照组与病例组均为汉族，年龄差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。本研究经宁夏医科大学伦理学委员会审核批准，所有研究对象均签署知情同意书。

2.SNPs的确定：通过文献查阅，严格按选点要求筛选并确定ER基因的SNPs位点：以1000 Genomes及NCBI数据库中的HapMap-HCB(中国北京汉族)分型数据为参照，选取了ER基因外显子区及对外显子剪切、拼接可能有影响，但生物学功能尚不明确的内含子区域共4个SNPs(ERα：rs2234693、rs9340799，ERβ：rs1256049、rs4986938)进行研究(表1)。

表1 入选基因及SNP位点定位

3.DNA提取：EDTA抗凝管无菌采集2(5ml静脉血，存于-80℃冰箱；北京天根公司全血DNA试剂盒提取DNA，1510全波长酶标仪测定DNA纯度及浓度。

4.基因分型：采用美国ABI公司(http://www.lifetechnologies.com)设计并合成的TaqMan探针，通过ABI7500fast实时荧光定量PCR仪进行基因初步分型。PCR反应体系：5μl (含2×Primer Mix 2.5μl，三蒸水1.275μl，40×Taqman探针0.125μl，50×ROX 0.1μl，模板DNA 1μl)。扩增条件：95℃预变性20s；变性95℃ 3s；退火60℃ 30s；延伸60℃ 1min；循环40次，4℃保存。根据结果中质量报告、散点图、荧光扩增曲线，参照NCBI(http：//www．ncbi．nlm．nih．gov/)群体数据库对初步分出的基因型进行最终确定。

5.统计学方法：应用SPSS 22.0统计学软件对所得数据进行统计分析处理。SNPs位点基因型分布的群体代表性以Hardy-Weinberg(H-W)平衡检验；对照组与病例组间基因型及等位基因频率分布的差异性比较采用χ2检验；比值比(OR)和95%可信区间(95% CI)采用二元Logistic回归计算，以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1.H-W平衡检验：经检验，4个SNPs位点基因型及等位基因频率在所选研究对象中的分布均符合H-W平衡(P均>0.05)，表明所选对象有群体代表性。

2.基因分型：Taqman探针基因分型结果参考NCBI上北京汉族人群相关结果进行分析。结果显示,rs2234693分出3种基因型，即CC、CT和TT；rs9340799分出3种基因型，即AA、AG和GG；rs1256049分出3种基因型，即AA、AG和GG；rs4986938分出3种基因型，即AA、AG和GG。

3.ER基因(ERα、ERβ)4个单核苷酸多态性位点基因型及等位基因频率的分布：对照组及病例组ER基因4个单核苷酸多态性位点基因型及等位基因频率分布的差异性比较结果表明，ERα基因rs2234693位点等位基因分布频率在两组间比较,差异有统计学意义(P<0.05)，隐性模型下，CC+CT和TT基因型在两组的分布频率比较，差异有统计学意义(P<0.05，表2)。ERα基因型频率及ERβ基因rs1256049、rs4986938两位点基因型与等位基因频率分布在两组间比较，差异均无统计学意义(P均>0.05，表2、表3)。

表2 对照组与病例组ERα基因基因型及等位基因分布频率的比较[n(%)]

讨 论

人类雌激素受体是配体活化的转录因子，尽管其亚型ERα和ERβ具有高度的同源性，但其功能可能并不完全相同[17]：ERα主要调节排卵效率、卵泡生长及卵母细胞的发育，而ERβ主要在受精中起关键作用[8,9]。

Pineda等[12]对ERα基因单核苷酸多态性位点与西班牙女性RSA的相关研究表明，病例组rs2234693和rs9340799位点TT基因型和AA基因型的分布频率与对照组相比较均显著增高，推测ERα基因这两个位点多态性与该地区女性RSA有关。关菁等[13]对中国北京女性RSA患者ERα基因相关研究结果亦显示，rs2234693的基因型分布频率在病例组和对照组之间比较，差异有统计学意义，但rs9340799位点多态性在两组间比较，差异无统计学意义，故认为rs2234693位点多态性与北京妇女RSA的发病风险有一定关联。不同的是，Aléssio等[14]对巴西RSA患者ERα基因上述2个SNPs进行的研究结果显示，ERα基因多态性与当地妇女RSA无关。本研究结果发现，rs2234693位点基因型及rs9340799位点基因型和等位基因在病例组与对照组的分布频率的差异均无统计学意义，但rs2234693位点等位基因(C、T)频率在两组的分布频率比较，差异有统计学意义(χ2=5.131，P=0.024，OR=1.498，95% CI：1.055～2.126)，提示 T等位基因与RSA呈正相关(OR>1)，携带T等位基因型可能会增加女性发生RSA的风险，且隐性模型下，CC+CT和TT基因型在RSA患者组的分布频率分别为76.8%、23.2%， 而其在对照组中的分布频率分别为84.7%、15.3%，两组间比较差异有统计学意义，携带TT基因型的女性发生RSA的风险是(CC+CT)基因型女性的1.86倍，提示，携带TT基因型的患者更容易发生RSA，呈T隐性遗传模式。以上结果说明ERα基因rs2234693多态性位点与宁夏回族自治区汉族女性RSA有一定关联。以往研究表明，ER基因敲除的成年雌鼠生殖功能严重缺陷，出现子宫、宫颈和卵巢发育不全，卵泡发育过程中闭锁提前，成熟卵泡减少，并表现出不孕[18]。可见ER基因功能异常可导致生殖系统发育的一系列异常，在女性可能影响其妊娠结局。由此推测，本研究结果中ERα基因rs2234693位点多态性的变化可能使ERα基因在转录、翻译水平失调，影响了基因的表达，从而妨碍了雌激素的生化作用及其与ER间功能效应，导致卵泡发育异常及排卵障碍，使卵细胞的受孕能力及胚胎分化发育能力降低，同时使子宫内膜容受性与受精卵发育不同步，最终使胚胎不能正常发育致使流产的发生，但真正原因尚需更多研究证实。本研究结果验证了Pineda等[12]和关菁等[13]的相关研究结果，但与Aléssio等[14]对巴西妇女的结果不同，提示ERα基因2个SNPs的分布可能存在种族及地区差异。

表3 对照组与病例组ERβ基因基因型及等位基因分布频率的比较[n(%)]

以往对ERβ基因单核苷酸多态性位点与不同地区、不同种族女性RSA的研究显示，ERβ基因 rs1256049、rs4986938 2个单核苷酸位点多态性与伊朗妇女RSA的发生有一定关系，但与韩国、巴西等妇女RSA并无显著关联[12,19，20]。郭春燕等[16]对中国重庆地区妇女的相关研究亦未发现ERβ基因上述2个位点多态性与当地女性RSA的发病有关。由于ERβ基因rs1256049位点基因型分布在亚洲人和高加索人间的存在差异，而伊朗人群该基因型的分布频率接近于高加索人群，因此，与韩国及中国研究结果一致[12,16,19]。本研究通过比较分析ERβ基因2个SNPs位点(rs1256049、rs4986938)多态性在宁夏回族自治区汉族女性的分布特征发现，两个位点基因型和等位基因分布频率在病例组与对照组的分布频率差异均无统计学意义；同时，进一步在显性模型及隐性模型下对其分布特征进行比较，仍未发现其分布频率在两组间差异有统计学意义，故说明宁夏回族自治区汉族女性RSA的发生与ERβ基因多态性可能无明显关联，具体原因尚无法解释。与ERα基因类似，此结果从某种程度上也提示，ERβ基因单核苷酸多态性位点可能也具有种族和地区差异性。

综上所述，本研究结果一定程度上提示ERα基因rs2234693位点单核苷酸多态性与宁夏汉族女性RSA的发病风险有一定相关性，若此结果可被诸多同行在不同地区及不同人群得以验证，则可为RSA的早期预防和诊断提供有利的参考信息。但是，ER基因其他位点与RSA间是否存在关联并未得到证实，尚需今后开展深入研究阐明。