马尾松根际土壤浸提液对种子萌发和幼苗生长的化感作用

(1.贵州大学林学院/贵州省森林资源与环境研究中心， 贵阳 550025;2.贵州省林业调查规划院， 贵阳 550025)

马尾松(Pinusmassoniana)是我国南方主要的造林和用材树种，具有速生、丰产，适应性强等特性，在林业生产及森林生态系统中占有十分重要的地位，是典型的外生菌根树种[1]。现有40科500余种的外生菌根真菌能与马尾松形成共生关系。外生菌根的形成有利于宿主植物对养分和水分的吸收，增强酶活性以及产生有机酸等物质来提高植物生存能力。然而，大面积经营马尾松纯林导致林地地力衰退、生产力下降、天然更新困难，土壤作为植物化感物质存在的主要场所，根系分泌物是化感物质的主要来源[2]，因此，化感在森林更新和森林衰退中起到重要作用，尤其对自毒作用的树种所形成的人工单优群落影响最大。

植物的化感作用指植物在自然界中通过自身的分泌挥发等途径向自然环境中释放化学物质，这种物质会促进或抑制周围植物的生长发育[3]。植物的化感作用能影响种子萌芽与生长，并在杂草控制和防治病虫害方面都有重要作用[4]。近年来，国内外学者对化感作用的研究比较多，鲍红春等[5]研究发现，不同部位沙芥水浸提液均对白菜种子萌发及幼苗生长产生抑制作用，且抑制作用随浸提液浓度的增加而加强。陈娟等[6]研究发现，土壤浸提液抑制苦槠幼苗的生长和光合作用，在低浓度时，毛竹的茎秆、叶片和枯落物对苦槠的生长具有促进作用。李苇洁等[7]用不同浓度的紫茎泽兰叶片浸提液处理白刺花种子及幼苗，发现浸提液对白刺花的影响为低浓度促进，高浓度抑制。曹光球等[8]以马尾松针叶、根、枯落叶和腐叶等器官浸提液为对象，研究其化感物质组成及其对自身的化感作用。而对于菌根化马尾松苗木根际土壤浸提液对种子到苗木整个生长过程的研究较少。因此，本研究以菌根化和非菌根化马尾松幼苗根际土壤浸提液为研究对象，探索菌根化和非菌根化马尾松根际土壤浸提液对自身种子萌发和幼苗生长的影响，了解马尾松的化感效应及生理机制，以期为马尾松天然更新和菌根化马尾松苗木培育提供科学依据和理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验种子采自贵州省都匀市马尾松国家良种基地。试验所用菌种由西南大学黄建国教授提供，包括褐环乳牛肝菌(Suillusluteus，简称Sl)Sl12和Sl13两个菌株。采用Pachlewski培养基对菌种进行培养和扩繁。

1.2 试验方法

1.2.1播种及土壤处理

采用条播方式，土壤用0.5%的高锰酸钾溶液进行消毒灭菌，薄膜覆盖处理，晾晒通风7 d，马尾松种子用0.5%的高锰酸钾溶液消毒并催芽，待种子裂嘴露白时播种于分别浇洒Sl12和Sl13两种菌丝液体的苗床上，覆土。不接种则喷洒等量的无菌培养液。

1.2.2根际浸提液的提取与制备

分别选取生长一致的各处理一年生幼苗，轻抖根系，将不易抖落黏附在细根表面的土壤用灭菌的刷子刷下作为根际土壤。称取200 g根际土壤3份，4 ℃冷藏备用。提取方法采用乙醇三性萃取浸提法[9]，并在其基础上进行改进。用乙醇分别对3种根际土壤进行浸提，得到其浸提液，35 ℃真空旋转蒸发仪旋转浓缩，无水硫酸钠脱水，因旋转浓缩得到的部分根系分泌物不易溶于水，需取1 mL分析纯乙醇溶解根系分必物，配制浓度为1 mg·mL-1母液，将此母液稀释成0.25，0.5，1.0 mg·mL-1根系分泌物溶液，浓度分别为低、中、高3个浓度水平。另取1 mL乙醇至100 mL容量瓶中蒸馏水定容，作为对照组(1%乙醇)，保证各浓度的分泌物溶液中均含1%乙醇，置于4 ℃冰箱中保存备用。

1.2.3种子萌发试验

采用培养皿滤纸法，将培养皿和滤纸置于120 ℃高压灭菌锅中消毒3 h，之后在各培养皿中垫2～3层滤纸。每个培养皿放置100粒种子，加入5 mL(以淹没种子1/3为准)不同处理的根际土壤乙醇浸提液。每个处理3次重复，用1%的乙醇溶液为对照，置于人工气候培养箱中，设定温度25 ℃，湿度80%，光照和黑暗各12 h，每天补充等量的相应浓度处理液，保持培养皿内的滤纸湿润，第5天开始统计发芽粒数，第20天时测其发芽率、发芽势、胚根、胚轴、鲜重与干重，并计算化感效应指数[10]，当T≥C时，RI=1-C/T；当T

1.2.4幼苗生长试验

将生长一致的一年生马尾松幼苗移栽在花盆(25 cm×20 cm)中，缓苗30 d后进行处理，每7 d分别向容器内浇灌不同浓度处理的根际土壤乙醇浸提液300 mL，15 d测量1次马尾松苗木的苗高和地径，对照浇灌等量1%的乙醇，4个月后全株收获，105 ℃杀青15 min，80 ℃恒温烘干至衡重，测定生物量。

1.2.5数据处理

数据采用SPSS 18.0软件进行统计分析，用单因素方差分析(one-way ANOVA)、Duncan法对数据进行显著性检验和多重比较，采用Excel软件进行数据处理和图表制作。

表1 马尾松根际土壤浸提液对种子萌发的影响

苗木种类处理统计指标发芽率/%RI活力指数RI发芽指数RIck1%乙醇82.67±6.11b—104.57±15.59b—16.55±1.38b—1.079.33±7.02a-0.0433.02±3.72a-0.6812.80±1.28a-0.23不接种0.593.00±1.00b0.1198.15±2.26b-0.0618.17±0.92b0.090.2594.67±1.16b0.13128.50±8.15c0.1918.57±0.74b0.111.066.67±3.01a-0.1933.13±1.46a-0.6812.45±0.56a-0.25Sl120.588.33±3.51b0.0694.24±19.62b-0.1018.27±0.47c0.330.2586.67±3.06b0.05110.86±11.54b0.0617.36±0.53bc0.281.065.33±7.58a-0.2134.13±4.12a-0.6711.92±2.01a-0.28Sl130.590.00±2.00b0.0860.17±7.18b-0.4217.78±0.91b0.070.2588.67±4.62b0.0785.38±3.75b-0.1817.73±0.99b0.07

注：同列数据后不同小写字母表示差异达显著水平(p<0.05)。下同。

表2 马尾松根际土壤浸提液对芽苗生长的影响

苗木种类 处理统计指标胚轴长/cmRI胚根长/cmRI鲜重/gRI干重/gRIck1%乙醇3.44±0.34b—2.86±0.25c—0.37±0.03a—0.07±0.00a—1.02.11±0.06a-0.390.46±0.02a-0.840.32±0.02a-0.140.08±0.01a0.13不接种0.53.20±0.09b-0.072.21±0.10b-0.230.53±0.04b0.300.09±0.01a0.220.253.33±0.41b-0.033.60±0.26d0.210.60±0.05b0.380.08±0.00a0.131.02.17±0.21a-0.370.50±0.10a-0.830.34±0.04a-0.080.08±0.00a0.13Sl120.53.05±0.27b-0.112.10±0.75b-0.270.46±0.07b0.200.08±0.01a0.130.253.31±0.19b-0.043.07±0.65b0.070.52±0.03b0.290.08±0.00a0.131.02.38±0.10a-0.310.50±0.09a-0.830.35±0.02a-0.050.08±0.00a0.13Sl130.52.18±0.26a-0.371.20±0.10b-0.580.53±0.02b0.300.09±0.00b0.220.252.98±0.11b-0.131.84±0.25c-0.360.53±0.02b0.300.09±0.00b0.22

2 结果与分析

2.1 马尾松根际土壤浸提液对种子萌发的化感作用

由表1可知，在高浓度下，与对照(1%乙醇)相比，种子的发芽率分别降低了4.04%，19.35%，20.97%，种子的活力指数分别降低了68.4%、68.3%、67.4%，发芽指数分别降低了22.66%，24.77%，27.98%，在中低浓度时，对种子的发芽率和发芽指数均表现为促进作用。由此可见，土壤浸提液对种子萌发的抑制作用随着浓度的降低而减弱。

2.2 马尾松根际土壤浸提液对芽苗生长的化感作用

由表2可知，不同浓度根际土壤浸提液均会对种子胚轴长产生抑制作用，高浓度时，与对照(1%乙醇)相比，不接种、Sl12、Sl13处理下，胚轴长分别降低38.67%，36.91%，30.81%，差异显著(p<0.05)；不同浓度根际土壤浸提液对种子胚根长的影响与胚轴长一致，并在高浓度时达显著水平；在高浓度时，对芽苗鲜重抑制作用不明显，中低浓度均具有显著促进作用；对芽苗干重，在不同浓度时均表现为促进作用。由此可见，随着根际土壤浸提液浓度增加，胚根长和鲜重具有明显浓度效应，并随浓度的增加逐渐降低。

2.3 马尾松根际土壤浸提液对苗木生长的化感作用

由图1可知，在不同浓度下，不接种、Sl12和Sl13苗高均高于对照(1%乙醇)处理，表现出明显的浓度效应，浓度越低，促进作用越强；不同浓度处理下Sl12和Sl13的促进作用均高于不接种处理，促进作用的大小表现为不接种

由表3可知，在高浓度时与对照(1%乙醇)相比，根际土壤浸提液对幼苗的总鲜重、总干重、地上部分和地下部分生物量的积累均有抑制作用，在中低浓度时，对幼苗的总鲜重、地上部分表现为明显的促进作用，在低浓度时，苗木的总鲜重分别增加了44.34%，50.76%，56.45%，总干重增加了42.46%，44.74%，60%，差异显著；在各个浓度处理下，马尾松根际土壤浸提液对苗木地下部分生物量的积累均有促进作用。由此可见，马尾松根际浸提液对苗木生物量的积累均有低浓度促进高浓度抑制作用。

图2 马尾松根际土壤浸提液对MDA、SOD、POD活性的影响

表3 马尾松根际土壤浸提液对苗木生物量的影响

苗木种类处理总鲜重/gRI总干重/gRI 地上部分 地下部分 鲜重/g干重/g鲜重/g干重/gck1%乙醇15.11±2.21a—5.70±1.52ab—12.96±1.61b4.92±1.26a2.15±0.65a0.78±0.26a1.012.28±0.86a-0.194.47±0.52a-0.229.68±0.81a3.44±0.51ab2.61±0.20ab1.03±0.04abc不接种0.518.52±1.02b0.186.65±0.82bc0.1415.24±1.23c5.27±1.08b3.29±1.48abcd1.38±0.71abc0.2521.81±1.79c0.318.12±0.84cd0.3017.39±1.49c6.42±0.55bc4.41±0.44d1.70±0.30c1.012.99±0.31a-0.145.19±0.21ab-0.0910.33±0.82a3.87±0.37ab2.66±0.51ab1.32±0.27abcSl120.520.83±0.92bc0.276.73±0.71bc0.1517.98±0.75c5.34±0.58b3.36±0.72abcd1.40±0.29abc0.2522.78±1.27c0.348.25±0.73cd0.3118.75±1.70c6.60±0.68d4.34±0.69cd1.72±0.28c1.013.19±2.25a-0.135.04±0.82ab-0.1210.63±1.45a4.11±0.34ab2.56±1.10ab0.93±0.52abSl130.521.24±2.25bc0.297.78±0.88cd0.2718.40±0.57cd6.53±0.86d2.84±0.91abcd1.26±0.38abc0.2523.64±2.39c0.369.12±1.81d0.3819.90±1.87cd7.51±1.47d3.74±0.75bcd1.61±0.40bc

图1 马尾松根际土壤浸提液对苗木苗高、地径的影响

2.4 马尾松根际土壤浸提液对MDA含量、SOD和POD活性的影响

由图2可知，不同浓度根际土壤浸提液处理后苗木MDA的含量均低于对照(1%乙醇)，在中高浓度时，与对照相比，除不接种外，Sl12和Sl13均无显著差异；低浓度时，不接种、Sl12根际土壤浸提液处理后苗木MDA含量降低了6.53%和32.68%。SOD活性随根际土壤浸提液浓度的升高而降低。与对照(1%乙醇)相比，Sl12和Sl13苗木根际土壤浸提液提高苗木SOD的活性，活性大小为Sl13>Sl12>不接种。而苗木POD活性变化趋势与SOD变化趋势相同，在中高浓度下，对苗木POD活性无显著差异，低浓度时，Sl13根际土壤浸提液处理后苗木体内POD活性增加16%，差异显著。

3 讨 论

化感物质具有复合性、质量浓度效应、选择性、专一性和复杂多样性[11]。在本研究中，马尾松根际土壤浸提液对种子萌发和幼苗生长都是低浓度促进，高浓度抑制，这与段剑等[12-14]在白刺花对紫茎泽兰化感作用的研究中发现，紫茎泽兰叶片浸提液对白刺花生长的影响为低浓度促进，高浓度抑制有相似之处。与陈立新等[15]认为的高浓度的土壤浸提液对种子萌发和幼苗生长均产生抑制作用，低浓度下，抑制作用减弱，甚至消失转变为促进作用等都相似。并且还与黄文静等[16]认为的当归根际土壤水浸提液对自身和黄芪种子萌发、幼苗生长，渗透调节物质的积累均有抑制作用，作用强度随浓度的增加而增强的结果都相似。由此说明，化感作用对受体植物的作用类型及强度与浓度极其相关。

发芽率、发芽指数、苗高、根长等往往被视为衡量化感效应强弱的重要指标。其中根长更容易受到化感作用的影响。研究表明，薄壳山核桃根系水浸提液各浓度处理对幼苗根长、苗高、鲜质量和干质量的化感效为：根长>苗高>鲜质量>干质量，其中对胚根长的化感作用最大[17-20]。张婷等[21]研究表明，在中低浓度下，接种外生菌根真菌根际土壤浸提液对马尾松种子的萌发没有显著性差异。张瑞琦等[22]研究中发现，4种草本植物浸提液对长柄扁桃种子的萌发均具有化感作用，且存在显著的浓度效应。本研究结果发现，低浓度的根际土壤浸提液处理可增加种子的发芽率、活力指数、发芽指数、胚根长和生物量的积累，并随土壤浸提液浓度增加，化感抑制作用增强，呈现浓度效应，而胚轴长的RI均为负值，表现为抑制作用。综上所述，种子在萌发过程中受到浸提液中化感物质的影响，产生了化感作用。其原因可能是种子在萌发过程中，胚根首先接触到浸提液中的化感物质，化感物质又通过改变膜透性、代谢途径、抑制细胞分裂或伸长等途径影响种子的萌发和幼苗的生长。

超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化酶(POD)在保护细胞膜系统和避免活性氧对有机体的毒害中起着重要作用，是植物体内主要的抗氧化保护酶，酶活性的高低反应了植物自我解毒的能力。此外，植物在遭受逆境胁迫时, 也会引起体内抗氧化酶系统和渗透调节物质发生变化[23]，氧自由基的毒害会发生膜脂过氧化作用，其产物MDA会严重损伤细胞膜系统，从而影响植株的生长[24-25]。鲍红春等[5]对不同浓度沙芥水浸提液处理后白菜幼苗体内的SOD、POD活性随着浓度的增大而降低，MDA含量随浓度的增大而增大。张权等[17]对薄壳山核桃的研究表明，生长7 d的幼苗体内，SOD活性降低，MDA含量、POD活性与对照相比均随浓度的增加而增加。本研究结果表明，随着根际土壤浸提液浓度增加，苗木体内SOD、POD活性降低，MDA含量增加，这与前人的研究结果相似。原因可能是自由基代谢或活性氧代谢失衡，引起自由基的积累和膜脂过氧化，从而导致质膜结构和功能受损，对马尾松产生化感作用。同时，根际土壤浸提液中化感物质由多种物质组成，化感作用机理复杂多样，因此，关于马尾松根际土壤浸提液对马尾松幼苗代谢中酶活性的影响等生理机制有待进一步研究。

4 结 论

在马尾松种子萌发阶段，马尾松苗木根际土壤浸提液对种子发芽率、活力指数、发芽指数、胚轴长、胚根长、干鲜重具有一定的影响，总体表现为高浓度的根际土壤浸提液对种子的萌发具有抑制作用，低浓度有促进作用；马尾松苗木根际土壤浸提液对种子的发芽率和发芽指数化感作用大小表现为Sl12

在幼苗生长阶段，接种Sl12和Sl13根际土壤浸提液促进马尾松苗高、地径生长和生物量的积累，降低苗木体内MDA含量，提高苗木SOD，POD酶活性，并存在显著的浓度效应。