利用KASP分子标记技术辅助筛选多抗 番茄材料

李宗俊 王先裕 刘梦姣 崔馨月 赵 雄 陈 鹏 欧青青

（广西大学农学院，广西南宁530001）

广西地区气候潮湿、降雨量多、春秋季节常见阴雨天，在这种环境下番茄晚疫病（Tomato late blight）产生的致病疫霉（Phytophthora infestans）极易存活并侵染植株（郑海武和李正英，2016）。番茄晚疫病是番茄上的常见病害，直接影响果实的产量与品质（路世竑，2018），每年减产10%～20%，严重时可以达到80%甚至绝产（陈宇飞 等，2000）。番茄晚疫病是由致病疫霉侵染所引起的一种真菌性病害，在广西地区以A1 基因型为主要存在形式，优势生理小种为T1，2和T1，2，3，4，5（朱桂宁 等，2007）。目前晚疫病主要通过合理调整栽培制度、使用特定的化学抑菌剂、种植含有抗性基因的品种等方式进行防治（郑海武和李正英，2016），使用高抗晚疫病的品种是防治番茄晚疫病最为经济有效的措施（李明远，2017）。

番茄对晚疫病的抗性是典型的数量遗传性状，由Ph-1、Ph-2、Ph-3、Ph-4、Ph-5-1 和Ph-5-2等基因位点控制（胡明瑜 等，2018），对晚疫病的遗传抗性已被证明可以减少晚疫病田间发病率，从而减少化学药剂的使用（杜敏敏 等，2017）。在目前生产利用中，Ph-3 不仅抗多个生理小种并且在杂合状态下也表现出较好的抗性，是较有优势的一个基因位点（张春芝，2014）。利用分子标记等方式辅助常规育种技术进行抗病材料的筛选可以节省大量时间、人工成本，更加有利于我国抗病番茄产业的发展（杜敏敏 等，2017）。

本试验通过将田间抗性鉴定与KASP（kompetitive allel-specif ic PCR）分子标记辅助选择结合运用来高效筛选出田间表现为抗病且具有优良经济性状的番茄材料，从而为选育抗晚疫病的番茄优良新品种奠定一定基础。

1 材料与方法

2018 年9 月初在广西壮族自治区武鸣定标水库旁番茄试验基地进行大田试验，10 月在广西大学农学院园艺植物分子生物实验室进行室内试验。

1.1 试验材料

参试的16 份番茄材料由广西大学农学院番茄课题组提供，均为在连续多年发生晚疫病的试验田中筛选收集的健康茂盛、经多代自交纯化的番茄材料。其特性来源见表1。

表1 供试番茄材料及来源

1.2 试验方法

1.2.1 DNA 的提取及KASP 分子标记检测 DNA的提取采用CTAB 法，并且参考了番茄基因组DNA 的提取方法（刘秀丽 等，2017）。称取0.2 g左右的新鲜番茄叶片置于研钵中，加入液氮研磨至泛白粉末状，迅速转移适量粉末至2 mL 离心管中，加入65 ℃ CTAB 提取缓冲液,充分摇匀后置于65 ℃恒温水浴锅加热40 min，冷却至室温后加入等体积的酚/氯仿/异戊醇，充分摇匀后10 000 r · min-1离心10 min，提取上清液加入等体积氯仿/异戊醇，充分摇匀再10 000 r · min-1离心10 min，提取上清液加入醋酸钠以及异丙醇，混匀后放入-40 ℃冰箱静置30 min，在4 ℃条件下10 000 r · min-1离心10 min，弃上清液用75%乙醇洗涤沉淀2 次，晾干后加入TE 溶液溶解DNA，放入-40 ℃冰箱 待用。

使用蛋白质核酸分析仪检测DNA 质量，以OD260/OD280在1.80～2.00 之间为宜。将DNA 送至北京通州国际种业科技有限公司，利用KASP 标记检测SNP 位点。设计引物进行PCR 扩增，采用Douglas 软件进行数据分析和基因型确认。

1.2.2 田间抗病性鉴定 2018 年12 月进行晚疫症田间抗病性调查，采取五点取样法调查番茄植株田间感病状况，每个品种大约调查40 m2。将番茄晚疫病病情分为6 个等级（康立功，2006），具体 见表2。

病情指数（DI）=∑（各级病株数×该病级值）/（调查总株数×最高级值）×100

高 抗（HR），0 ≤DI ＜10； 抗 病（R），10 ≤DI ＜30；中抗（MR），30 ≤DI ＜50；感病（S）：50 ≤DI ＜70；高 感（HS）：DI ＞70（康立功，2006）。

表2 番茄晚疫病病情分级标准

1.2.3 果实性状测定 2018 年12 月，在番茄结果期每个品种随机选择5 株，在第3 穗果上采5～10个果实进行果实性状测定。采用桂林量具刃具有限责任公司生产的0～150 mm 电子数显卡尺测量番茄果实横、纵径，计算果形指数；采用竹村电机制作所生产的硬度计测定果实硬度；采用成都泰华光学有限公司生产的手持式折光仪测定果实含 糖量。

1.2.4 数据分析 利用Microsoft Excel、Word 以及SPSS 20.0 统计分析软件进行试验数据统计分析。

2 结果与分析

2.1 番茄晚疫病抗性检测结果

田间调查结果显示（表3），16 份番茄材料中对晚疫病抗性较好的有10 份，其中LF-15、LF-35、LF-41、AL-21、AL-55 的病情指数均为0，表现高抗，LF-23 也对晚疫病表现高抗，LF-5、LF-7、LF-11、AL-51 表现为抗病。

田间晚疫病抗病性调查数据与分子标记试验结果基本一致。根据KASP 分子标记检测结果（表3、图1～4），16 份材料中有3 份材料含晚疫病纯合体抗性基因Ph-3，2 份材料含番茄黄化曲叶病毒病纯合体抗性基因Ty-1，4 份材料含番茄黄化曲叶病毒病纯合体抗性基因Ty-3，10 份材料含黄萎病纯合体抗性基因Ve-2，LF-15、LF-35、LF-41 等3 份材料同时含有4 种抗性基因，其中LF-35 含有的4种抗性基因皆为纯合体。

表3 番茄材料田间抗性调查与KASP 分子标记结果

图1 番茄材料晚疫病抗性基因Ph-3 的KASP 分子标记检测结果

图2 番茄材料番茄黄化曲叶病毒病抗性基因Ty-1 的KASP 分子标记检测结果

图3 番茄材料番茄黄化曲叶病毒病抗性基因Ty-3 的KASP 分子标记检测结果

图4 番茄材料黄萎病抗性基因Ve-2 的KASP 分子标记检测结果

2.2 番茄果实田间性状调查

从表4 可以看出，16 份番茄材料中只有LF-30与AL-51 为有限生长型，其他材料皆为无限生长型；果形指数在0.79～1.03 之间，除LF-41 为高圆形外其他材料皆为扁圆形；果实硬度在0.56～0.81 kg · cm-2之间，AL-10 的硬度最高，AL-21 的硬度最低；LF-37、AL-1、AL-51 为中度裂果，LF-5、LF-66 不易裂果，其他材料无裂果现象；含糖量在4.0%～6.0%之间，酸甜比例合适；LF-5、LF-7、LF-35、LF-37、LF-41、AL-7、AL-51、AL-55 等8 份材料无果肩，其余材料皆有果肩。

3 结论与讨论

本试验从16 份番茄材料中筛选出3 份同时含有4 种抗性基因的材料LF-15、LF-35、LF-41，其中LF-35 的4 种抗性基因皆为纯合体；这3 份材料皆为无限生长型，LF-41 为高圆形，LF-15、LF-35 为扁圆形，硬度皆在0.70 kg · cm-2以上，没有裂果现象，含糖量在4.0%～5.5%之间，LF-15有果肩。3 份材料均具有十分优良的经济性状，可以为将来抗性育种筛选聚合多抗番茄材料提供更多 选择。

本试验使用第三代分子标记技术，利用KASP标记基于已知SNP 检测来辅助番茄育种，大大节省了常规番茄育种的时间，提高了番茄抗病育种效率。在实践过程中，由于第二代分子标记技术SSR 是基于凝胶条带中的观察，会出现操作观察的错误，比如条带显色较弱或者条带分离不完全等。与第一、二代分子标记技术不同，KASP 基因测定使用新型均相荧光检测系统（Devran et al.，2016），该技术依赖于等位基因特异性单核苷酸延伸和荧光共振能量转移（FRET）来产生信号，具有分布密度高、遗传稳定性好、二等位基因型等特点，更容易实现高通量和自动化检测（刘丽华 等，2018）。本试验田间晚疫病抗病性调查数据与分子标记试验结果基本一致，表明KASP SNP分子标记能够显著提高抗病育种中抗性基因的筛 选率。

综上所述，新开发的KASP 标记在筛选番茄育种群体时显示出一致的结果，将为在短时间内快速准确地分析许多样品提供机会。然而，由于市场和消费者的需求，商业番茄品种的遗传和物理特性迅速变化，因此未来KASP 标记应该在具有不同遗传背景的番茄中进行测试，以确定大群体中标记的效率。在该研究之后，与番茄中的其他抗性基因相关的分子标记也可以转化为KASP 技术，应用于分子标记辅助选择以及抗病新种质的培育中。