大白菜根肿病菌生理小种鉴定研究

张淑霞 张清霞 司朝光 李 剑 王殿纯 杨晓云*

（1 青岛市农业科学研究院，山东青岛 266100；2 青岛国际种苗有限公司，山东青岛 266100）

大白菜根肿病是由芸薹根肿菌（Plasmodiophora brassicae Woron.）侵染引起的一种世界性病害。该病为土传性真菌病害，受侵染的根组织发生异常并大量增生，膨大形成瘤状肿根，根系正常生理机能受到影响，导致根系生长和吸收能力受损，造成减产或绝收。该病自1936 年在我国台湾地区发现已来，目前全国大部分地区均有发生，对大白菜生产造成极大破坏。由于该病菌休眠孢子囊能在无寄主的土壤中存活7 a 以上，田间一经发病将长期带菌，严重威胁大白菜的可持续生产，而田间栽培防范、化学药剂防治该病效果不佳，因此选用抗病品种就成为防治该病的有效方法。

Honig（1931）首次证实根肿病菌存在生理小种分化。目前国际上通用的生理小种鉴别系统有两个：Williams 鉴别系统（Williams，1966）和欧洲根肿病鉴别系统（ECD）（原玉香 等，2017）。由于后者鉴别品种多达15 个，鉴定用植株多、所需空间大等原因影响了其应用；前者的鉴别品种只有4个，易于操作，结果计算简单，因而应用较多。国内大多数应用Williams 鉴别系统对大白菜根肿病菌进行生理小种鉴定的报道，均发现了强致病力小种4 号生理小种（丁云花 等，2013；刘峰 等，2013；彭宇龙 等，2018）。但原玉香等（2017）使用ECD鉴别系统鉴定时认为4 号生理小种可进一步划分为不同的类型。Kuginuki 和Yasuhisa（1999）认为，Williams 鉴别系统和ECD 鉴别系统在鉴定时表现出波动而不能区分出病菌的差别。青岛市农业科学研究院大白菜课题组前期利用Williams 鉴别系统对采自全国大白菜主产区及青岛市农业科学研究院的16 份大白菜根肿病菌菌源进行生理小种鉴定，并用已育成的抗根肿病大白菜品种同时进行鉴定。结果表现为4 号生理小种居多，但是却出现了抗4 号生理小种的大白菜品种对来自其他地区的4 号生理小种表现感病的情况。这说明4 号生理小种本身可能存在致病力的分化，或是该鉴别系统未能精确鉴定出生理小种的种类。本试验继续采用Williams 鉴别系统，同时选用具有不同根肿病抗性的大白菜品种对来源不同的20 份大白菜根肿病菌进行致病力分化的研究，旨在为大白菜根肿病菌生理小种的精确划分和抗病育种提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试根肿病菌菌源采自全国多地，代号及来源详见表2。所有菌源均经过镜检，观察到休眠孢子囊和游动的休眠孢子，确认为芸薹根肿菌；-20 ℃冰箱保存。

Williams 鉴别系统的4 个鉴别寄主分别为结 球 甘 蓝Jersey Queen 和Badger shipper， 芜 菁Laurentian 和Wilhelmsburger（表1）。

抗根肿病大白菜品种为青研CR20（青岛市农业科学研究院）、金锦（福州建农播王种苗有限公司）、德高CR117（德州市德高蔬菜种苗研究所）、青研CCR69（青岛市农业科学研究院）；感病对照（CK）为青研春白1 号（青岛市农业科学研究院）。

1.2 试验方法

试验于2018 年8 月20 日至9 月25 日在青岛市农业科学研究院育苗温室内进行。将保存于-20 ℃冰箱内的菌根解冻，采用菌土法进行接种。具体步骤：按0.02∶1（质量比）的比例将经搅拌机打碎后的菌根放入基质（品氏托普育苗基质）中混匀过夜，第2 天将基质装入72 孔穴盘中，播种。每个处理10 株，3 次重复。温室温度保持在22～28 ℃，接种35 d 后进行病情调查。

1.3 病情分级标准及Williams 鉴别系统生理小种划分标准

病情分级标准参考丁云花和简元才（2005）的标准：0 级，无症状；1 级，侧根有小肿瘤；3 级，侧根和主根上有较大肿瘤，呈圆形；5 级，侧根和主根上有大肿瘤，呈纺锤形；7 级，侧根和主根上的纺锤形肿瘤连成片；9 级，肿瘤扩展至下胚轴，侧根和主根全部为大块肿瘤。

根据各根肿病菌菌源对Williams 鉴别系统4 个鉴别寄主的抗感反应来确定其生理小种类型 （表1）。

2 结果与分析

2.1 Williams 鉴别系统鉴定结果

从表2 可以看出，20 份大白菜根肿病菌菌源对Williams 鉴别系统的4 个鉴别寄主均有很强的致病力，除13 号菌源和17 号菌源为2 号生理小种外，其他18 份菌源均为4 号生理小种，说明4 号生理小种在参试根肿病菌菌源中数量最多、分布 广泛。

表1 Williams 鉴别系统

表2 20 份大白菜根肿病菌菌源生理小种鉴定结果

2.2 抗根肿病大白菜品种对不同根肿病菌菌源的抗性表现

从表3 可以看出，4 个不同育种单位选育的抗根肿病大白菜品种对20 份根肿病菌菌源的抗性反应可以划分为6 个类别。其中，SSSS 类型包括的菌源最多，共9 份，占参试菌源的45%；其次为TTST 类 型，4 份；PTST 类 型 为3 份，STSP 类 型为2 份，PPSS 类型和TTPT 类型均为1 份。以上结果说明由Williams 鉴别系统划分为同一生理小种的根肿病菌菌源对于不同大白菜抗病品种的致病力表现并不一致，根据4 个抗根肿病大白菜品种的抗性鉴定结果可进一步将4 号生理小种划分为6 个不同的致病类型：菌源6、8、9、10、12、14、15、16、19 号的致病力最强（SSSS 类型），致病力最弱的是4 号菌源（TTPT 类型）。由Williams 鉴别系统鉴定为2 号生理小种的菌源13 号和17 号对4 个抗根肿病大白菜品种的致病力表现亦不同，分别为TTST 类型和PTST 类型，而菌源13 号与4 号生理小种的菌源1、3、5 号对抗根肿病大白菜品种的表现型相同，菌源17 号与4 号生理小种的菌源2、7号的表现型相同。

表3 4 个抗根肿病大白菜品种对不同根肿病菌菌源的抗性鉴定结果

3 结论与讨论

近年来十字花科根肿病的发生逐年严重，面积不断扩大，选用优质高抗品种成为防治该病的最佳途径。抗病育种的首要前提是弄清病原菌的生物学特性及致病性。国内使用Williams 鉴别系统已鉴定出的根肿病菌生理小种有2 号、4 号、7 号、10 号和11 号，其中以4 号居多。本试验结果表明，不同的抗根肿病大白菜品种对来源不同的4 号生理小种表现出不同的抗性，说明Williams 鉴别系统中鉴别寄主品种过少难以精细区分根肿病菌菌源的差异，另一方面也可能是鉴定所用的根肿病菌菌源不是单孢系，而是两个或多个生理小种的混合物，致病力不同的生理小种所占比例不同造成对寄主品种的致病性不同。

这种鉴定为同一生理小种但对不同大白菜品种抗性表现不同的情况在前期试验中也多次出现，因此本次试验增加4 个大白菜品种作为辅助鉴别寄主共同进行生理小种的鉴定工作。结果同为4 号生理小种的18 份根肿病菌菌源根据对4 个大白菜品种的不同抗感反应划分成6 种致病力不同的类型，同为2 号生理小种的13 号和17 号菌源也被划分成2种类型。这一方面表明参试的根肿病菌菌源中可能存在比4 号生理小种致病力更强的菌株，Williams鉴别系统已不能精确划分，这与原玉香等（2017）的研究结果相似；另一方面，菌样未进行单孢分离，可能是多个小种的混合体，这也造成生理小种划分上的困难。本试验中使用的大白菜品种是在以往多次试验的基础上筛选出来的，抗病基因分子标记鉴定也表明这4 个品种分别具有不同的抗根肿病基因（待发表），今后根肿病菌生理小种划分试验中可以考虑使用与抗根肿病基因分子标记鉴定结果相对应的高代自交系或DH 系，鉴定结果将更稳定、可靠，同时与快速简便的单孢分离培养技术相结合，才能更好地划分根肿病菌生理小种，为抗病育种提供良好的保证。