QuEChERS-液相色谱-串联质谱法测定牛蛙肉中酰胺醇类抗生素及其代谢物

黄思聪 龙敏仪

摘 要：采用QuEChERS技术提取氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考及其代谢物氟苯尼考胺，建立液相色谱-串联质谱法（liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）同时测定牛蛙肉中酰胺醇类抗生素及其代谢物的检测方法。结果表明：在0.1～50.0 ng/mL范围内，酰胺醇类抗生素及其代谢物质量浓度与其质谱响应值呈良好的线性关系，相关系数均大于0.999 1;检出限为0.007 5～0.003 0 μg/kg，定量限为0.025～0.100 μg/kg;加标回收率为94.3%～97.9%，相对标准偏差为0.8%～3.7%。

关键词：酰胺醇类抗生素;液相色谱-串联质谱法;QuEChERS;牛蛙肉

Abstract： A quick， easy， cheap， effective， rugged and safe （QuEChER） extraction procedure followed by a liquid chromatography-tandem mass spectrometry （LC-MS/MS） assay was established for the simultaneous determination of amphenicol antibiotics （chloramphenicol， thiabendazole and florfenicol） and the florfenicol metabolite florfenicol amine （FFA） in bullfrog meat. The results showed that there was a good linear relationship between the mass spectrometric response and concentrations of all analytes in the range from 0.1 to 50.0 ng/mL with correlation coefficients all greater than 0.999 1. The limits of detection and quantitation were in the range from 0.007 5 to 0.003 0 μg/kg and from 0.025 to0.100 μg/kg， respectively. The recoveries from spiked samples were in the range from 94.3% to 97.9%， with relative standard deviation of 0.8% to 3.7%.Keywords： amphenicol antibiotics; liquid chromatography-tandem mass spectrometry; QuEChERS; bullfrog meat

DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20190428-091

中圖分类号：TS251.7                                        文献标志码：A 文章编号：1001-8123（2019）06-0039-05

引文格式：

黄思聪， 龙敏仪. QuEChERS-液相色谱-串联质谱法测定牛蛙肉中酰胺醇类抗生素及其代谢物[J]. 肉类研究， 2019， 33（6）： 39-43. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20190428-091.    http：//www.rlyj.net.cnHUANG Sicong， LONG Minyi. Determination of amphenicol antibiotics and metabolite residues in bullfrog meat by QuEChERS-liquid chromatography-tandem mass spectrometry[J]. Meat Research， 2019， 33（6）： 39-43. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20190428-091.    http：//www.rlyj.net.cn

牛蛙（Rana catesbiana Shaw），俗名美国水蛙，是一种经济价值较高的大型食用蛙[1-2]，原产于北美洲和墨西哥[3-4]，因个体硕大、生长快、产量高，且肉质细嫩、味道鲜美、营养丰富，具有滋补解毒功效，已成为世界各大洲养殖的主要食用蛙种[5-7]。但牛蛙在养殖过程中易发生病毒性、细菌性、真菌性等疾病，部分养殖场为追求利益而添加大量具有广谱抗菌功效的氯霉素（chloramphenicol，CAP）、甲砜霉素（thiamphenicol，TAP）和氟苯尼考（florfenicol，FF）等酰胺醇类抗生素[8-9]，但若这些抗生素使用不当会残留在牛蛙肉中，危害消费者的健康。毒理学研究表明，CAP可引起再生障碍性贫血和粒状白细胞缺乏症等疾病，美国、中国规定在动物食品中CAP不得检出;TAP不易引起再生障碍性贫血，但可抑制红细胞、白细胞和血小板的生成[10-12];FF为CAP和TAP的替代药物，既克服了易产生耐药性和造成再生障碍性贫血的缺陷，又具有较强的抗菌活性，且具有抗菌谱广、吸收好、生物利用度高等特点，但FF具有一定的胚胎毒性，美国[12]、欧盟[13]、中国[14-16]均对TAP和FF的残留量作了限量规定。因此，有必要建立牛蛙肉中酰胺醇类抗生素及其代谢物的检测方法。

目前，酰胺醇类抗生素的检测方法有气相色谱法（gas chromatography，GC）[17]、液相色谱法（liquid chromatography，LC）[18]、气相色谱-质谱法（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）[19]和液相色谱-串联质谱法（liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）[20-22]，但其中GC和HPLC无法提供目标物的结构信息，灵敏度不高;GC-MS因衍生化处理样品前处理繁琐;LC-MS/MS具有分离能力强、灵敏度高等特点，且操作简便，适合低残留多组分同时测定[23-24]。QuEChERS（Quick， Easy， Cheap， Effective， Rugged and Safe）是一种快速的样品前处理技术，具有回收率高、准确度高、分析速度快等特点，QuEChERS-LC-MS/MS已用于水产品和畜禽产品中农药、兽药残留检测[25-26]。本研究采用QuEChERS技术提取净化牛蛙肉中的CAP、TAP、FF及FF代谢物氟苯尼考胺（florfenicol amine，FFA），建立LC-MS/MS法同时测定牛蛙肉中酰胺醇类抗生素及其代谢物的方法。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

CAP、TAP、FF、FFA标准物质（纯度均大于99%）   德国Dr.Ehrenstorfer公司;N-丙基乙二胺（分析纯）美国CNW公司;氯化钠、无水硫酸镁（均为分析纯）   天津龙腾化工有限公司。

1.2 仪器与设备

LC-MS 8050高效液相色谱-串联四级杆质谱联用仪、AUW220D电子分析天平 日本岛津株式会社;JJ-2B匀浆机 江苏常州金坛区西城基铭实验仪器厂;VORTEX旋涡混合器 上海达姆实业有限公司;Scientz-800 CQ超声波提取振荡反应器 宁波新芝生物科技股份有限公司;Allegra X-22R高速冷冻离心机 德国Beckman公司;Milli-Q超纯水系统 美国Millipore公司;TTL-DC氮吹仪 北京同泰联科技发展有限公司;中性氧化铝柱（规格500 mg/6 mL） 天津博纳艾杰尔科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 样品前处理

精密称取粉碎混匀5.0 g牛蛙肉样品置于50 mL离心管中，依次加入纯乙腈10 mL、无水硫酸镁3 g、氯化钠2 g和乙二胺-N-丙基硅烷（ethylenediamine-N-propyl silane，PSA）150 mg，涡旋振荡1 min，超声振荡提取10 min（频率40 kHz，功率800 W），10 000 r/min离心5 min;上清液经中性氧化铝柱净化，用3 mL乙腈淋洗，收集流出液，45 ℃氮吹近干，用乙腈定容至1 mL，0.22 μm微孔濾膜过滤，滤液供LC-MS/MS测定。

1.3.2 溶液配制

标准储备液：准确称取酰胺醇类抗生素及其代谢物标准品各10 mg，用乙腈溶解并定容至100 mL，配制成质量浓度为100 μg/mL的标准储备液。

1.3.3 液相色谱条件

色谱柱：Shim-pack GIST C18柱（100 mm×2.1 mm，2.0 ?m）;流动相A为乙腈，流动相B为纯水;流速0.3 mL/min;进样量10.0 μL;柱温40 ℃。梯度洗脱程序：0～1 min，20%流动相A;1～2 min，20%～60%流动相A;2～3 min，60%～95%流动相A;3～8 min，95%流动相A;8～8.1 min，95%～20%流动相A;8.1～10 min，20%流动相A。

1.3.4 质谱条件

离子化模式：电喷雾离子源（electron spray ionization，ESI），负离子扫描;扫描模式：多反应监测（multiple reaction monitoring，MRM）;碰撞气：氩气，纯度>99.99%;加热气：氮气，流速10 mL/min;雾化气：氮气，流速3 mL/min;干燥气：氮气，流速10 mL/min;接口温度300 ℃;脱溶剂管温度250 ℃;加热模块温度400 ℃。

1.4 数据处理

每组实验重复6 次，结果表示为平均值，采用SPSS 16.0软件进行数据分析。

2 结果与分析

2.1 质谱条件的优化

将1.0 μg/mL酰胺醇类抗生素单标以在线流动注射方式进样。由于酰胺醇类抗生素结构式中含有氟、氯、羟基等官能团，在ESI源负离子模式下可产生带负电荷的分子离子峰[M-H]-，故选择负离子扫描模式，在50～500 m/z范围内进行母离子扫描;通过自动优化模式，找出丰度较强的碎片离子，选择丰度最强的碎片离子为定量离子，优化后的碰撞能量、锥孔电压等参数如表1所示。

2.2 色谱柱的选择

以酰胺醇类抗生素及其代谢物的峰面积和分离度为指标，分析Diamonsil C18、Agilent Zorbax SB C18、Waters X-Bridge C18、Shim-pack ODS C18和Shim-pack GIST C18等不同色谱柱对牛蛙肉中酰胺醇类抗生素及其代谢物的分离效果。结果表明：在相同流动相条件下，Shim-pack GIST C18色谱柱可有效分离酰胺醇类抗生素及其代谢物，更适合分析各目标物;采用粒径（2.0 ?m）和内径（2.1 mm）相同的Shim-pack GIST C18色谱柱，50 mm柱用时短，但不能保证目标物均有良好的峰形，而100 mm柱用时较短，且各目标物峰形尖锐、对称，酰胺醇类抗生素及其代谢物的提取离子总离子流图如图1所示。酰胺醇类抗生素单标质量浓度10.0 ng/mL。

2.3 流动相的选择

采用Shim-pack GIST C18柱（100 mm×2.1 mm，2.0 ?m）作为分析柱，考察甲醇-水、甲醇-0.1%甲酸、乙腈-水、乙腈-0.1%甲酸、甲醇-10 mmol/L乙酸铵、乙腈-10 mmol/L乙酸铵等流动相对酰胺醇类抗生素及其代谢物的分离效果及其质谱响应情况。结果表明：在ESI源负离子模式下，水相采用纯水比采用0.1%甲酸或10 mmol/L乙酸铵更容易使酰胺醇类抗生素及其代谢物电离形成带负电荷的分子离子峰[M-H]-，且峰形良好;有机相采用乙腈比采用甲醇具有更好的分离效果和灵敏度;采用乙腈-水为流动相时，酰胺醇类抗生素及其代谢物的质谱响应值较高，且经梯度洗脱后可有效分离

2.4 QuEChERS提取溶剂的选择

根据酰胺醇类抗生素及其代谢物的极性，结合QuEChERS前处理方法，选择乙腈、酸化乙腈（0.1%盐酸）、二氯甲烷和乙酸乙酯作为提取溶剂，通过空白牛蛙肉加标回收实验进行提取效果的比较。结果表明：乙腈和酸化乙腈对酰胺醇类抗生素及其代谢物的提取效果最好，提取回收率为86.3%～98.6%，这可能是由于牛蛙肉中脂肪和蛋白质含量高，乙腈和酸化乙腈沉淀蛋白质和提取能力比较强，结合QuEChERS方法（无水硫酸镁脱水、PSA吸附糖类、脂肪酸等有机酸及色素）与固相萃取净化（中性氧化铝柱吸附极性物质和除脂）可有效去除蛋白质和脂肪，但酸化乙腈提取物中残留的酸会对酰胺醇类抗生素的质谱检测产生干扰，重现性不理想;乙酸乙酯对酰胺醇类抗生素的提取效果较好，但对FFA提取效果较差，提取回收率约为82.7%;二氯甲烷对目标物的提取效果较好，但二氯甲烷提取物中脂肪和蛋白质较多，影响后续净化，且耗时。因此选择乙腈作为提取溶剂。

2.5 基质效应的消除

为消除LC-MS/MS法测定牛蛙基质中酰胺醇类抗生素及其代谢物的基质效应，采用标准添加法分析纯乙腈和不含目标物的空白牛蛙样品中的基质效应（matrix effect，ME）[20]。

由表2可知：在纯乙腈和不含目标物的空白牛蛙样品2 种基质中分别加入10、250、500 μg/kg酰胺醇类抗生素及其代谢物标准溶液，按上述QuEChERS-LC-MS/MS法测定目标物质谱响应强度，重复测定6 次，计算所得ME值为2.4%～5.3%，说明采用QuEChERS-LC-MS/MS法测定牛蛙肉中酰胺醇类抗生素及其代谢物时不存在基质干扰。

2.6 线性范围、检出限与定量限

依次配制质量浓度分别为0.1、0.5、1.0、10.0、50.0 ng/mL的酰胺醇类抗生素及其代谢物标准溶液，按上述LC-MS/MS法进行测定，以目标物质量浓度为横坐标（x），质谱响应值为纵坐标（y），绘制标准曲线。

由表3可知：在0.1～50.0 ng/mL范围内，酰胺醇类抗生素及其代谢物质量浓度與其质谱响应值呈良好的线性关系，相关系数均大于0.999 1。采用国际纯粹与应用化学联合会（International Union of Pure and Applied Chemistry，IUPAC）推荐的方法，对11 份不含目标物的空白牛蛙样品进行加标测定，以3 倍信噪比（RS/N=3）为方法检出限，以10 倍信噪比（RS/N=10）为方法定量限，得酰胺醇类抗生素及其代谢物的检出限为0.007 5～0.030 0 μg/kg，定量限为0.025～0.100 μg/kg。

2.7 加标回收率和精密度

在不含目标物的空白牛蛙样品中分别加入0.1、25.0、50.0 μg/kg酰胺醇类抗生素及其代谢物标准溶液，按上述LC-MS/MS法进行测定，每个添加水平测定6 次，计算回收率和相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）。

由表4可知：在0.1～50.0 μg/kg加标范围内，酰胺醇类抗生素及其代谢物的平均加标回收率为94.3%～97.9%，RSD为0.8%～3.7%，符合方法学的要求，表明该法准确度高、精密度好。

2.8 实际样品分析

按本研究所建QuEChERS-LC-MS/MS法测定30 份市售牛蛙肉中酰胺醇类抗生素及其代谢物残留量，结果表明，2 份样品中分别检出含有CAP、TAP残留，其中CAP残留量高达187.3 μg/kg，这可能是由于牛蛙饲养过程中感染病毒性、细菌性等疾病，使用酰胺醇类抗生素药物残留所致，市场监管部门应加强监督检验。

2.9 与文献方法比较

将本研究所建QuEChERS-LC-MS/MS法与现有文献报道[20-24]、国家标准[27-28]及行业标准[29-30]的相关检测方法进行比较，并从仪器、检测对象、检出限、精密度和回收率等方面进行比较。

由表5可知，采用QuEChERS方法进行样品前处理，经LC-MS/MS对牛蛙肉中酰胺醇类抗生素及其代谢物进行分析，在检出限、精密度和回收率等方面均取得较为满意的结果。

3 结 论

本研究采用QuEChERS技术提取净化牛蛙肉中的CAP、TAP、FF及FF代谢物FFA，成功建立LC-MS/MS法同时测定牛蛙肉中酰胺醇类抗生素及其代谢物的方法。该法前处理简单、分离效果好、灵敏度高、准确度好，可为牛蛙肉中酰胺醇类抗生素残留检测及确证提供方法。

参考文献：

[1] Renata R， Xavier J F， Andreza M， et al. Thermo-oxidative stability evaluation of bullfrog （Rana catesbeiana Shaw） oil[J]. Molecules， 2017， 22（4）： 606-610. DOI：10.3390/molecules22040606.

[2] Lin Meixi， Zhang Shan， Yao Meng. Effective detection of environmental DNA from the invasive American bullfrog[J]. Biological Invasions， 2019， 21（3）： 1-14. DOI：10.1007/s10530-019-01974-2.

[3] Adam S， Megan L， Dave S， et al. Invasion of American bullfrogs along the Yellowstone river[J]. Aquatic Invasions， 2015， 10（1）： 69-77. DOI：10.3391/ai.2015.10.1.07.

[4] Gobel N， Laufer G， Cortizas S. Changes in aquatic communities recently invaded by a top predator： evidence of American bullfrogs in Acegua， Uruguay[J]. Aquatic Sciences， 2019， 81（1）：25-32. DOI：10.1007/s00027-018-0604-1.

[5] Liu Xuan， Luo Yu， Chen Jiaxin， et al. Diet and prey selection of the invasive american bullfrog （Lithobates catesbeianus） in southwestern China[J]. Asian Herpetological Research， 2015， 6（1）： 34-44. DOI：10.16373/j.cnki.ahr.140044.

[6] Evaristo G P C， Pinkse M W H， Chen T B， et al. De novo sequencing of two novel peptides homologous to calcitonin-like peptides， from skin secretion of the Chinese frog， Odorrana schmackeri[J]. EuPA Open Proteomics， 2015， 8（9）： 157-166. DOI：10.1016/j.euprot.2015.07.008.

[7] NAVA A F， NAVA M O， LEYVA E G， et al. A comparison of the effects of three water-circulation regimes on the aquaculture of bullfrog （Rana catesbeiana Shaw） tadpoles[J]. Aquaculture， 1994， 128（1）： 105-114. DOI：10.1016/0044-8486（94）90106-6.

[8] 楊宏亮， 黄珂， 李刘冬， 等. 2015—2017年市售贝类产品中氯霉素的暴露评估[J]. 南方水产科学， 2019， 15（1）： 93-99. DOI：10.12131/20180089.

[9] 杭小英， 叶雪平， 周冬仁， 等. 牛蛙链球菌病的诊断和防治[J]. 水产养殖， 2012， 33（2）： 48-49. DOI：10.3969/j.issn.1004-2091.2012.02.021.

[10] 赵霞， 王波， 谢恺舟， 等. 动物性食品中氯霉素类药物残留色谱和质谱检测技术研究进展[J]. 分析试验室， 2018， 37（8）： 978-985. DOI：10.13595/j.cnki.issn1000-0720.2018.0190.

[11] 杨洁， 杨钊， 于宙， 等. 超高效液相色谱-串联质谱法测定禽蛋中氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素[J]. 分析试验室， 2016， 35（12）： 1463-1467. DOI：10.13595/j.cnki.issn1000-0720.2016.0330.

[12] Sumate K N， Pakawadee S， Pongsak L H， et al. Magnetic molecularly imprinted polymer prepared by microwave heating for confirmatory determination of chloramphenicol in chicken feed using high-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry[J]. Journal of Environmental Science and Health： Part B， 2018， 53（11）： 738-745. DOI：10.1080/03601234.2018.1480161.

[13] CUI Binbin， YANG Jing， WANG Zhibin， et al. An ultra-high performance liquid chromatography with tandem mass spectrometry method for determination of 10 alkaloids in beagle dog plasma after the oral administration of the Corydalis yanhusuo W.T. Wang extract and Yuanhuzhitong tablets[J]. Molecules， 2018， 23（8）： 1925-1931. DOI：10.3390/molecules23081925.

[14] JIA Bingjie， Huang Jun， LIU Juxiang， et al. Detection of chloramphenicol in chicken， pork and fish with a molecularly imprinted polymer-based microtiter chemiluminescence method[J]. Food Additives and Contaminants： Part A， 2019， 36（1）： 572-579. DOI：10.1080/19440049.2018.1562238.

[15] 马燕红， 李志刚， 陈超. 食品中氯霉素类药物残留量检测方法研究进展[J]. 肉类研究， 2016， 30（7）： 35-38. DOI：10.15922/j.cnki.rlyj.2016.07.008.

[16] Ma Wei， Wang Na， Li Songtian， et al. Synthesis and properties of B-Ni-TiO2/g-C3N4 photocatalyst for degradation of chloramphenicol （CAP） under visible light irradiation[J]. Journal of Materials Science： Materials in Electronics， 2018， 29（16）： 13957-13969. DOI：10.1007/s10854-018-9529-7.

[17] 楊秋红， 艾晓辉， 李荣， 等. 固相萃取-气相色谱法同时检测水产品中的氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考和氟苯尼考胺[J]. 分析实验室， 2015， 34（5）： 533-537. DOI：10.13595/j.cnki.issn1000-0720.2015.0118.

[18] 孙情， 王宝维， 张乐乐. 液相色谱法检测畜禽食品中氯霉素残留研究进展[J]. 肉类研究， 2011， 25（10）： 40-42.

[19] 邵会， 冷凯良， 周明莹， 等. 水产品中氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考、氟苯尼考胺多残留的同时测定： GC/MS法[J]. 渔业科学进展， 2015， 36（3）： 137-141. DOI：10.11758/yykxjz.20150321.

[20] 陈晓兰， 陈未， 王帅兵， 等. HPLC-MS/MS法测定鸭肉中氯霉素类药物残留[J]. 江苏农业科学， 2016， 44（12）： 316-319. DOI：10.15889/j.issn.1002-1302.2016.12.098.

[21] 杨洁， 杨钊， 于宙， 等. 超高效液相色谱-串联质谱法测定禽蛋中氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素[J]. 分析试验室， 2016， 35（12）： 1463-1467. DOI：10.13595/j.cnki.issn1000-0720.2016.0330.

[22] 肖利龙， 张鑫鑫， 花锦. 高效液相色谱-串联质谱同时测定蜂胶中氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素残留量[J]. 化工设计通讯， 2016， 42（9）： 73-74. DOI：10.3969/j.issn.1003-6490.2016.09.057.

[23] Moghazy A Y E， Zhao C Y， Istamboulie G， et al. Ultrasensitive label-free electrochemical immunosensor based on PVA-co-PE nanofibrous membrane for the detection of chloramphenicol residues in milk[J]. Biosensors and Bioelectronics， 2018， 117（2）：838-844. DOI：10.1016/j.bios.2018.07.025.

[24] 李贞， 陈科. LC-MS/MS法快速筛查辣椒制品中8 种禁用苏丹染料[J]. 食品研究与开发， 2019， 40（3）： 167-172. DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2019.03.030.

[25] 李丽春， 刘书贵， 尹怡， 等. QuECHRS结合UPLC-MS/MS法测定水产品中酰胺醇类抗生素残留及基质效应[J]. 中国渔业质量与标准， 2018， 8（6）： 32-39. DOI：10.3969/j.issn.2095-1833.2018.06.005.

[26] 方从容， 高洁， 王雨昕， 等. QuEChERS-超高效液相色谱-串联质谱法测定鸡蛋中125 种兽药残留[J]. 色谱， 2018， 36（11）： 1119-1131. DOI：10.3724/SP.J.1123.2018.06007.

[27] 中国肉类食品综合研究中心， 中国商业联合会商业标准中心，武汉市疾病预防控制中心， 等. 肉与肉制品 氯霉素含量的测定：GB/T 9695.32—2009[S]. 北京： 中国标准出版社， 2009.

[28] 中华人民共和国秦皇岛出入境检验检疫局， 中华人民共和国广东出入境检验检疫局. 河豚鱼、鳗鱼和烤鳗中氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考残留量的测定 液相色谱-串联质谱法： GB/T 22959—2008[S].北京： 中国标准出版社， 2008.

[29] 浙江省检验检疫科学技术研究院， 中华人民共和国上海出入境检验检疫局. 出口动物源食品中甲砜霉素、氟甲砜霉素和氟苯尼考胺残留量的测定 液相色谱-质谱质谱法： SN/T 1865—2016[S]. 北京： 中国标准出版社， 2016.

[30] 中华人民共和国农业部. 动物源食品中氯霉素残留量的测定 高效液相色谱-串联质谱法： 农业部781号公告-2—2006[S]. 北京： 中国标准出版社， 2006.