乌司他丁预处理对HepG2细胞氧化损伤保护作用的研究

杨巧侠 王成果 王元欣

摘要：目的  探讨乌司他丁（UTI）预处理对HepG2细胞氧化应激损伤的保护作用。方法  将HepG2细胞常规培养传代，随机分为H2O2组，UTI100+H2O2组、UTI500+H2O2组、UTI1000+H2O2组及对照组，其中对照组不作任何处理，H2O2组，UTI100+H2O2组、UTI500+H2O2组、UTI1000+H2O2组分别加入浓度为0 μmol/L、100 μmol/L、500 μmol/L、1000 μmol/L UTI预处理，24 h后加入300 μmol/L H2O2处理4 h，体外模拟肝细胞损伤。CCK-8试剂盒和LDH试剂盒检测LDH变化评价细胞损伤;TUNEL检测细胞凋亡率;Western blot检测HepG2细胞中LC3-Ⅱ、Cleaved caspase-3的表达变化情况。结果  与H2O2组相比较，CCK-8和LDH检测结果提示，各TUI预处理组能改善细胞生存环境，減轻H2O2对HepG2细胞的应激损伤，提高细胞活力（P<0.05）;TUNEL检测提示预处理可降低氧化应激导致的凋亡率（P<0.05）; Western blot结果提示，与H2O2组比较，UTI可上调LC3-Ⅱ的表达（P<0.05），促进细胞自噬的发生，降低Cleaved caspase-3表达，抑制细胞凋亡 （P<0.05）。结论  UTI可以通过激活LC3-Ⅱ表达，促进细胞自噬，发挥保护作用，拮抗氧化应激导致的细胞凋亡。

关键词：乌司他丁;自噬;凋亡;氧化应激

中图分类号：R575.1                                 文献标识码：A                                 DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2019.13.020

文章编号：1006-1959（2019）13-0072-05

Abstract：Objective  To investigate the protective effect of ulinastatin （UTI） preconditioning on oxidative stress injury in HepG2 cells.Methods  HepG2 cells were routinely cultured and randomly divided into H2O2 group， UTI100+ H2O2 group， UTI500+ H2O2 group， UTI1000+ H2O2 group and control group. The control group did not do any treatment. H2O2 group， UTI100+ H2O2 group， UTI500+ H2O2 group，UTI1000+ H2O2 group was pretreated with 0 μmol/L， 100 μmol/L， 500 μmol/L， and 1000 μmol/L UTI. After 24 h， 300 μmol/L H2O2 was added for 4 h to simulate hepatocytes in vitro. damage. CCK-8 kit and LDH kit were used to detect LDH changes to evaluate cell damage; TUNEL was used to detect apoptosis rate; Western blot was used to detect the expression of LC3-II and Cleaved caspase-3 in HepG2 cells. Results  Compared with the H2O2 group， the results of CCK-8 and LDH showed that each TUI pretreatment group could improve the cell survival environment， reduce the stress damage of  H2O2 on HepG2 cells， and increase cell viability （P<0.05）. TUNEL detection suggested pretreatment. The apoptosis rate induced by oxidative stress was reduced （P<0.05）.Western blot results showed that compared with H2O2 group， UTI could up-regulate the expression of LC3-II （P<0.05）， promote the occurrence of autophagy， decrease the expression of Cleaved caspase-3， and inhibit cell apoptosis （P<0.05）. Conclusion  UTI can promote the autophagy of cells by activating LC3-II expression， and play a protective role in antagonizing apoptosis induced by oxidative stress.

Key words：Ulinastatin;Autophagy;Apoptosis;Oxidative stress

肝脏担负着人体的重要生理功能，肝脏损伤引起肝功能代谢障碍，继而引起的一系列临床症状，对患者造成一定的痛苦和经济负担。药物性肝炎、病毒性肝炎、酒精性肝炎、自身免疫性肝病等肝病的共同病理基础是肝细胞损伤[1]。乌司他丁（ulinastatin，UTI）是从健康男性尿液提取的一种蛋白酶抑制剂，具有强大的广谱溶酶体酶抑制功能，具有稳定溶酶体膜，抑制溶酶体酶的释放，清除氧自由基及抑制炎症介质释放的作用[2]。临床上常用于急性胰腺炎、急性循环衰竭的救治。氧化应激是肝细胞损伤中一个重要的损伤机制，是各种肝脏疾病发生发展的共同病理基础[3]。本研究通过模拟离体急性肝细胞损伤，探讨UTI预处理对肝细胞自噬调控、凋亡的影响，为肝损伤的救治提供实验和理论依据。

1材料与方法

1.1材料  人肝癌细胞HepG2由中国科学院肿瘤医院提供;胎牛血清购自Gibco公司;DMEM及0.25%胰酶购自美国Invitrogen公司;兔抗小鼠LC3B、β-actin、Cleaved caspase-3抗体购自于美国CST公司;TUNEL细胞凋亡检测试剂盒美国Roche;山羊抗兔IgG/辣根酶标记二抗购自于武汉三鹰;细胞增殖-毒性检测试剂盒（cell counting Kit-8，CCK-8）购自于日本同仁公司;乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）试剂盒购自上海西唐生物科技有限公司。

1.2方法

1.2.1 HepG2细胞培养  将HepG2 细胞常规复苏，加入离心管中，吹打混匀，离心机中离心（800 r/min，5 min），弃上清，使用高糖型DMEM培养基并加10%胎牛血清配制而成的培养液，移入培养瓶中，于37℃ 5%CO2培养箱中常规培养。显微镜下观察细胞，待细胞长至约85%密度时，可以传代，经消化分散后，接种于塑料培养皿中，置于培养箱内进行培养。

1.2.2实验分组  将传代好的HepG2细胞分随机为5组，对照组不作任何处理，其余4组分别加入浓度为0 μmol/L、100 μmol/L、500 μmol/L、1000 μmol/L UTI预处理24 h后，加入300 μmol/L H2O2处理4 h，体外模拟肝细胞损伤。

1.2.3 CCK-8细胞活力检测  将HePG2细胞悬液浓度调整为5×107/L，每孔200 μL接种于96孔板上，按上述分组，每组接种8孔，经UTI预处理H2O2损伤后。加入20 μL 的CCK-8溶液在孵箱中继续孵育2 h，在全自动酶标仪450 nm下检测吸光度（optical density， OD）。

1.2.4 LDH释放量测定  各组经处理后，取其培养液。根据说明书配置标准品后，取其标准品和待测样品各5 μl加入96孔板，每孔再加入底物工作液100 μl，37℃孵育5 min读取吸光值A1。孵育30 min后用酶标仪在490 nm处测吸光值A2。再用A2值减去A1值等于最终OD值。以OD值为纵坐标，各标准品为横坐标，作标准曲线。根据样品OD值在该曲线图上查出相对应的LDH含量。

1.2.5 TUNEL检测细胞凋亡  4%多聚甲醛固定细胞，避光条件下，按9∶1混匀TUNEL试剂盒中的A液和B液，加入配置好的TUNEL反应液，加入待检测细胞爬片中，放入37℃恒温孵育1 h。PBS清洗后封片，Hoechst 染料染核5 min，在荧光显微镜下观察并拍照，计算凋亡率。凋亡率=TUNEL阳性细胞数/Hoechst细胞总数×100%。

1.2.6 Western blot检测LC3和Cleaved caspase-3表达变化  收集各组细胞，提取细胞总蛋白，考马斯亮蓝法测定蛋白浓度，聚丙烯酰胺凝胶电泳，分离蛋白后转移到硝酸纤维素膜上，和LC3（1∶3000）、Cleaved caspase-3（1∶500）与β-actin（1∶3000）抗体结合，然后与辣根过氧化物酶标记的二抗结合，电化发光法显色后照相。最后用Image master VDS成像系统摄影，图像分析件（Image J）行灰度扫描分析。以目的蛋白与β-actin的蛋白产物条带灰度值之比作为其蛋白水平的相对量。并进行扫描图像分析仪计算蛋白条带的表达。

1.3统计学方法  应用GraphPad prism 5软件处理数据。连续变量以（x±s）表示，组间比较用单因素方差分析，同组间两两比较用t检验进行统计学分析，以P<0.05表示差異有统计学意义，P<0.01表示统计学意义显著，P<0.001表示统计学意义极显著。

2结果

2.1各组CKK-8细胞活性检测结果比较  与对照组比较，H2O2组细胞活性显著下降为（46.30±1.40）%;而UTI100+H2O2组，UTI500+H2O2组，UTI1000+H2O2组细胞活性随浓度逐渐增强，分别为（53.58±1.80）%，（58.90±1.45）%，（66.08±0.89）%，见图1。

2.2 LDH释放量检测  结果显示，各UTI处理组与H2O2组比较，LDH检测率减少，差异有统计学意义（P<0.05），见表1。

2.3 TUNEL检测细胞凋亡  在荧光显微镜下观察细胞凋亡如图2所示。通过TUNEL阳性细胞计数，对照组阳性细胞（4.00±0.31）%，H2O2组神经元凋亡率达（62.80±0.86）%，UTI1000+H2O2组阳性细胞（34.00±0.70）%，对照组与H2O2组比较，统计学意义显著（P<0.01），见图3。

2.4 Western blot檢测LC3-Ⅱ和Cleaved caspase-3表达变化  Western blot结果提示，HepG2细胞H2O2处理后LC3-Ⅱ表达增高，随着UTI预处理浓度越大，LC3-Ⅱ表达进一步增高，与H2O2组相比较，差异有统计学意义（P<0.05）;同时，在H2O2损伤发生后升高明显，而UTI预处理组随着浓度增加，Cleaved caspase-3蛋白表达减少，与H2O2组相比较，差异有统计学意义（P<0.05），见图4。

3讨论

肝细胞损伤是一种由多因素介导的复杂的生物学过程，氧自由基的过度激活、脂质过氧化反应的引发和持续是肝病发生发展的重要病理过程之一[4]。正常生理情况下，自由基不断产生、被清除，维持在动态平衡的情况下。当体内抗氧化系统对自由基清除能力不足时，细胞结构和功能受到破坏，引起脂质过氧化、酪氨酸硝化、线粒体呼吸链一直等多种途径，造成核酸断裂、蛋白交联、变性和酶失活等。目前研究认为，氧化应激在肝脏疾病中的重要后果可能是改变了基因的表达，进而触发炎症反应、肝纤维化或癌变，或启动或加强凋亡[5]。而凋亡抑制因子可能通过攻击起关键作用的巯基，从而使Caspase丧失活性，通过抑制Caspase活性和参与调解核因子NF-kB的作用而抑制细胞凋亡，但这种攻击可能同时导致坏死，尤其当自由基的浓度很高时更易引发坏死[6]。

研究发现，乌司他丁能抑制氧自由基的产生，抑制多种炎症介质产生[7， 8]。临床常用于胰腺炎、脓毒症、多器官功能障碍综合征等疾病的治疗[9]。然而在多项颅脑损伤的研究中，证明乌司他丁可抑制神经细胞凋亡和死亡，改善神经细胞损伤，发挥脑保护作用[10-12]。有研究发现UTI可通过抑制多种炎症物质，如弹性蛋白酶、氧自由基等，避免其作用肺血管，改善肺水肿临床症状[13]。在大鼠的肝细胞损伤模型中，有人认为乌司他丁可以通过下调肝组织中NF-κB、p65表达，增强体内抗氧化能力[14]。而在UTI预处理可改善大鼠脓毒症模型对心脏组织的损伤，具有保护作用其作用机制可能与UTI对应激反应，细胞信号转导，能量代谢，免疫反应等相关基因表达的调节作用有关[15]。

本研究中，根据CCK-8活力检测和LDH释放检测，结果表明，HepG2细胞对H2O2氧化损伤敏感，H2O2处理后细胞活力显著降低，LDH漏出率明显升高，而通过乌司他丁预处理组观察，细胞活力有所增高。LC3-Ⅱ是自噬的标志性分子，其表达的高低与发生自噬的程度成正比[16]。Cleaved caspase-3表达水平反应了细胞的凋亡状况[17]。相关研究表明，在HCV 感染的肝细胞中出现自噬泡堆积现象，说明HCV病毒阻止自噬泡与溶酶体融合，从而避免病毒被溶酶体降解[18]。而通过脂多糖/D-半乳糖胺可以提高细胞中的自噬作用，保护野生型小鼠的急性肝损伤，细胞自噬对肝细胞具有保护作用[19]。因此，本研究进一步通过Western blot手段检测LC3-Ⅱ和Cleaved caspase-3表达。结果发现，与H2O2组比较，UTI处理组LC-Ⅱ表达增高，并呈浓度依赖性，Cleaved caspase-3表达则表达下降，说明通过UTI预处理，细胞自噬表达增强，凋亡分子表达减少。

氧化应激的发生在一定程度上会激活细胞的凋亡[20]，通过凋亡的发生可以阻断病毒复制或清除受损、衰老的肝细胞，维持肝脏内环境的稳定。而肝细胞过度凋亡会导致肝细胞坏死，严重的肝损伤、甚至肝功能衰竭的发生。自噬和凋亡两者之间可以相互转变，细胞内部可以通过应激依赖的幸存机制调控来恢复细胞使其达到稳态，所以，在外界条件刺激下，细胞会通过自噬清理受损线粒体，以避免凋亡因子进入细胞里激活凋亡信号。

肝损伤是临床上常见的疾病，对各种肝病所致的肝细胞损伤的病理机制至关重要，而寻找有效的防治药物仍然同样重要。尽管国内外目前关于UTI对肺损伤、胰腺炎和休克等危重伤病保护机制的研究，已经取得了极大的进展。但关于UTI在肝病中作用和机制研究较少，而对于UTI预处理可以影响细胞的转归，特别是凋亡和自噬的影响更值得我们进行深入的研究。

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收稿日期：2019-4-15;修回日期：2019-4-25

編辑/宋伟