补中益气汤对急性脑缺血大鼠行为学及脑损伤的影响❋

王 丹，毛 媛，刑晓娟

(庆阳市人民医院，甘肃 庆阳 745000)

作者简介：王 丹(1987-)，女,甘肃庆阳人，主治医师，医学硕士，从事神经内科的临床与研究。

急性脑缺血是常见的脑血管急症，主要由于颈动脉粥样硬化和斑块形成阻塞血管腔所致。急性脑缺血可导致局部组织缺血缺氧性损伤，引发神经功能缺损和认知障碍。我国脑梗塞的发病率高，且超过50%的患者可出现缺血缺氧性认知功能障碍[1]，因此对急性脑缺血后行为和认知功能采取有效措施进行改善至关重要。常规西医康复治疗对此类患者认知功能、神经功能和日常生活能力均有改善作用，但是仍有提升空间[2]。近年来，中医药在改善急性脑缺血后认知功能障碍患者认知功能方面的作用逐渐得到认可。补中益气汤可补中益气、养阴生津[3]，在脑梗塞恢复期效果确切[4]，但是关于其对急性脑缺血的作用及机制仍需探讨。

1 材料与方法

1.1 动物

50只SPF级SD成年雄性大鼠，体质量180～220 g，购自河南省实验动物中心(许可证号SCXK(豫)2017-015)。

1.2 药物

补中益气汤方组成：黄芪15 g，人参15 g，白术10 g，炙甘草15 g，当归10 g，陈皮6 g，升麻6 g，柴胡12 g，生姜9片，大枣6枚，中药材均购自天津药材公司，采用水提醇沉淀法提取药液，每1 ml药液相当于1 g生药。

1.3 实验器材

Morris水迷宫及其配套图像采集分析系统(宝生物(大连)科技有限公司)，SM2010R徕卡切片机(徕卡显微系统贸易公司)，电泳仪、CheniDoc XRS化学发光成像分析系统(美国Bio-Rad公司)； CX41-12C02型光学显微镜(日本Olympus公司)。

1.4 实验试剂

黑色染料(上海沪江钛白化工制品有限公司，批号20170506 A)；BCA蛋白定量分析试剂盒(Thermo公司，批号20170903)；B淋巴细胞瘤-2基因(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Caspase-3)、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Bax)兔抗鼠单克隆抗体(一抗)、Bcl-2、Caspase-3、Bax牛抗兔单克隆抗体(二抗)(北京中杉金桥生物技术有限公司，批号E2506、E2413、E2686、E2907、E2915、E2928)。

1.5 分组、造模及干预

将大鼠按随机数字表法分为假手术组、模型对照组及低、中、高剂量组各10只。建模方法：10%的水合氯醛腹腔麻醉，剂量为350 mg/kg，仰位固定并做颈正中切口，对右侧颈总动脉、颈外动脉、颈内动脉钝性分离迷走神经。由颈总动脉分叉处向头端游离，结扎右侧颈总动脉近心端、颈外动脉及其分支动脉，游离主干。分离右侧颈内动脉，沿其向下分离翼腭动脉，结扎根部，仅保留颈内动脉入颧骨主干。在颈外动脉近端备线，暂时夹闭其远端，由颈总动脉分叉处做切口并插入尼龙线(4～0)，推进并通过大脑中动脉起始处，阻断大脑中动脉部分血流并缝合皮肤。对侧操作方法同上。注意将大鼠体温维持在37.0～37.5 ℃。模型对照组和3剂量组均按照上述方法造模，假手术组除不插线外，其余操作均同上。术后2 h 低、中、高剂量组分别给予补中益气汤灌胃，参照文献[5]中大鼠临床等效剂量计算方法得出用药剂量，低剂量组0.5 g/kg，中剂量组1.0 g/kg，高剂量组1.5 g/kg，假手术组和模型对照组均给予2 ml生理盐水灌胃，每天1次，持续2周。

1.6 检测指标

1.6.1 行为学评价[6]BBB运动功能：持续干预2周后采用BBB运动功能评分评价，共分各关节活动能力(0～7分)、后肢步态及协调能力(0～5分)、运动过程中爪的精细动作(0～9分)3部分共21分，评分越高说明运动功能越理想。

Rivlin-Tator斜板试验：持续干预2周后采用Rivlin-Tator斜板试验评价，将大鼠放置在纹理厚度为1 mm的橡皮斜板上，使其身体长轴与斜板纵轴垂直，每次抬高斜板5°，以大鼠能停留5 s的最大角度即为功能值。

Morris水迷宫实验：持续干预2周后采用Morris水迷宫实验进行检测制作水迷宫，宫体直径150 cm，高60 cm，将水池等分为4个象限，并在宫壁标明4个对应入水点；安全岛位于第一象限，平台直径约为8 cm，大约高出水平面1 cm，内盛有温水，平台上放置少量饲料，水中掺入适量黑色染料。在水迷宫上安装摄像头记录大鼠运动轨迹，共包括定位航行训练和空间探索试验。定位航行训练：第1～5天进行定位航行训练，每天训练4次，间隔时间为2 h，随机选择入水点，将大鼠面向池壁轻放入水中。记录小鼠60 s内找到并登上安全岛的时间，为逃避潜伏期，若大鼠未能找到安全岛，则需要实验者对其进行引导使其停留30 s，将逃避潜伏期记录为60 s，将大鼠取出并擦干后放入饲养笼中；空间探索试验：第6天将安全岛撤除，随机选择入水点将大鼠放入水中，记录其60 s内的运动轨迹，统计目标象限内停留时间占比和目标象限内游泳距离占比。

1.6.2 脑指数测定 持续干预2周且完成上次检测后采用电子天平对大鼠的体质量进行称量，随即处死后立即取完整脑组织，称重后将其放置在冰盘上，脑指数=脑湿质量/体质量×100.00%。

1.6.3 海马区组织病理学观察变化 沿着端脑颞叶的内侧深部切取海马区脑组织块，10%福尔马林浸泡48 h，脱水、透明和石蜡包埋后进行HE染色，中性树胶封片在光学显微镜下观察。

1.6.4 海马区组织凋亡相关蛋白表达检测 取海马区组织，采用蛋白免疫印迹法(WB)对Caspase-3、Bcl-2、Bax进行检测。按蛋白提取试剂盒步骤提取总蛋白，并进行蛋白定量检测。每孔上样量为20 μg，十二烷基硫酸钠聚丙烯酰氨凝胶电泳(SDS-PAGE)电泳，电转仪电转120 min转膜。脱脂奶粉摇床封闭2 h，加入一抗(1∶1000)，4 ℃摇床孵育过夜，加入二抗(1∶10000)，常温孵育2 h，暗室中曝光、显影及定影。应用凝胶成像软件扫描拍照，使用BandScan灰度值分析软件分析，以Caspase-3、Bcl-2、Bax灰度值与内参β-actin灰度值比值为蛋白表达量。

1.7 统计学方法

2 结果

2.1 补中益气汤对急性脑缺血大鼠行为学和脑指数的作用

表1显示，假手术组干预期间无死亡，模型对照组与低、中、高剂量组干预期间分别有3只、2只、3只、3只大鼠死亡，因而假手术组、模型对照组、低、中、高剂量组样本量分别为10、7、8、7、7。与假手术组比较，模型对照组BBB评分、Rivlin-Tator斜板试验结果均显著降低(P<0.05)，3剂量组治疗后均有显著改善，其中高剂量组效果最为显著(P<0.05)。与假手术组比较，模型对照组逃避潜伏期时间延长，而目标象限内停留时间占比、目标象限内游泳距离占比降低(P<0.05)，脑指数显著增加(P<0.05)。经过药物治疗均有显著改善，其中高剂量组改善效果最为显著(P<0.05)。

表1 各组大鼠行为学和脑指数比较

注：与假手术组比较：aP<0.05；与模型对照组比较：bP<0.05；与低剂量组比较：cP<0.05；与中剂量组比较：dP<0.05

2.2 各组大鼠治疗前后海马脑区的病理染色结果

图1显示，假手术组可见神经元排列紧密、整齐，胞体饱满，结构清晰，分布均匀，数量无减少，无异常形态学改变，椎体细胞层排列紧致、规则，细胞轮廓清晰(图1 A)；模型组可见神经元严重排列稀松，神经组织结构不完整，有严重胞核溶解、细胞破裂现象，细胞周围高度水肿(图1B)；高剂量组可见神经元排列整齐，结构清晰，分布相对均匀，数量少有减少，椎体细胞层排列相对规则，细胞轮廓清(图1C)，与假手术组相近；中剂量组可见神经元有所改变，分布不均，数量减少，有部分胞核溶解、细胞破裂现象，椎体细胞层排列不规则，轮廓不清(图1D)；低剂量组可见神经元排列稀松，神经阻滞结构不完整，胞核溶解、细胞破裂明显，效果最差(图1E)。

图1 各组大鼠海马区病理染色结果比较(HE染色 ×200)

2.3 补中益气汤对急性脑缺血大鼠海马区脑组织凋亡相关蛋白相对表达量的作用

图2 各组Caspase-3、Bcl-2、Bax蛋白表达检测结果

图2表2显示，与假手术组比较，模型对照组Caspase-3、Bax蛋白相对表达量显著升高(P<0.05)，而Bcl-2蛋白表达量显著降低(P<0.05)。经过治疗后3剂量组Caspase-3、Bax蛋白相对表达量均有所降低(P<0.05)，Bcl-2蛋白表达量均有所升高(P<0.05)，其中高剂量组效果最为显著(P<0.05)。

表2 各组大鼠海马区组织凋亡相关蛋白相对表达量比较

注：与假手术组比较：aP<0.05；与模型对照组比较：bP<0.05；与低剂量组比较：cP<0.05；与中剂量组比较：dP<0.05

3 讨论

急性脑缺血发生后，由于血液和氧气供应不足，颅内神经可出现过氧化应激损伤，过多的氧自由基难以及时被清除，且可产生大量促炎症因子，各种病理学变化相互作用，共同诱发神经损伤[7]，导致神经功能障碍。而损伤的神经支配肢体功能将会出现明显的障碍，因此保护认知功能有助于改善脑缺血导致的认知与行为障碍。但目前临床仍缺乏有效的急性脑缺血后认知功能障碍患者行为学和认知功能的改善措施。

本次研究中发现，高剂量组行为学显著改善，且明显优于中剂量组和低剂量组，可知补中益气汤能够有效改善缺血缺氧性认知功能障碍大鼠的行为学，且高剂量组的效果最佳。此外，HE染色观察结果显示，正常组织和细胞结构、状态均正常，而高剂量组与正常对照组最为接近，提示补中益气汤对急性脑缺血大鼠认知功能的保护作用显著，且呈剂量依赖性。中医认为[8]，急性脑缺血属于中医学“卒中”范畴，根本病因在于气阴两虚、血瘀气滞、肝火上亢、风痰阻络等。补中益气汤围绕虚瘀下药，方中黄芪为君药，补中益气、固表升阳，臣以人参、炙甘草、白术健脾益气；当归养血和营，陈皮理气和胃，可使诸药补而不滞；升麻、柴胡升阳举陷，以升提下陷之中气；生姜可增强食欲、活血驱寒；大枣可补血益气，共为使药，诸药合用共达补中益气、养阴生津、养血和营之功效[9]。补中益气汤重用黄芪，以补中益气、升阳固表，且以升麻、柴胡协黄芪、人参升阳举陷、补气养血，使甘温之气充填内外，元气内充，故而该方剂可使气陷者升之，气虚者补之，清阳得升，元气得充，病恙得除，诸症自消。本研究中行为学和HE染色均发现，3剂量组结果显著改善，可知补中益气汤中诸多成分能够协同作用，对急性脑缺血大鼠发挥改善行为学和脑保护的作用，推测在临床中具有可行性，但仍需临床试验证实。现代药理研究证实[10-11]，黄芪、人参等补气中药能够增强机体的抗缺氧能力，改善缺氧状态，减轻氧化应激损伤和神经功能缺损程度，改善行为学。

本研究还显示，与假手术组比较，模型对照组海马区组织Caspase-3、Bax蛋白相对表达量显著升高，而Bcl-2蛋白表达量显著降低，可知在急性脑缺血大鼠中海马区组织Caspase-3、Bax蛋白表达异常升高，而Bcl-2蛋白表达异常降低。经过治疗后3剂量组Caspase-3、Bax蛋白相对表达量均下降，Bcl-2蛋白表达量均升高，其中高剂量组效果最佳，可知补中益气汤在急性脑缺血大鼠中应用能够下调Caspase-3、Bax蛋白表达，上调Bcl-2蛋白表达。大鼠海马区组织主要发挥记忆和空间定位作用，在急性脑缺血所致的脑损伤发生过程中出现海马区损伤，损伤其神经功能进而导致行为障碍。故本次研究选取海马区组织作为对象检测相关蛋白，探讨补中益气汤的作用机制。Bcl-2可通过调控细胞自身基因，启动死亡效应级联反应，在神经元细胞凋亡和认知功能损伤中发挥作用[12-13]；而Caspase-3是与Bcl-2相关的一类蛋白，且与Bcl-2高度同源，当Caspase-3同源二聚体含量升高，可加快神经元细胞的凋亡，加重认知功能损伤；Bax具有重要的调控神经元细胞凋亡的作用，正常情况下表达量低，一旦被激活，可通过细胞表面死亡受体途径或线粒体途径诱发细胞凋亡[14-15]。本研究中发现，采用补中益气汤能够调控凋亡相关蛋白，发挥对神经元的保护作用。推测补中益气汤能够通过下调Caspase-3、Bax蛋白表达、上调Bcl-2蛋白表达，抑制神经元细胞凋亡，改善急性脑缺血大鼠的行为学，发挥脑保护作用。

综上，补中益气汤能改善急性脑缺血大鼠的行为学，发挥脑保护作用，推测与下调Caspase-3、Bax蛋白表达，上调Bcl-2蛋白表达有关，但在急性脑缺血患者中的作用机制仍需深入探讨。