红色荧光蛋白融合表达载体的构建和蛋白质细胞内定位研究

王文旭　郁飞

摘要：为进一步研究目的蛋白质在细胞内的定位，构建融合了红色荧光蛋白mCherry或mScarlet的表达载体。选取VTI12、RabD2a、ARA7以及SYP61等4个定位基因来构建红色荧光蛋白融合表达载体。根据TAIR数据库中相关蛋白质的基因序列设计引物，通过PCR技术扩增序列并将其分别连接到已制备好的红色荧光蛋白融合表达载体上，制备得到质粒后转化入原生质体进行瞬时表达。结果表明，成功构建了pUC18HE-NmCherry-VTI12、pUC18HE-NmCherry-RabD2a、pUC18-mScarlet NT-ARA7以及pUC18-mScarlet NT-SYP61等4个红色荧光蛋白融合表达载体，并且成功在拟南芥叶肉细胞原生质体中瞬时表达。

关键词：红色荧光蛋白;融合表达载体;亚细胞定位;瞬时表达

中图分类号： Q943.2;S188+.2文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2019）08-0052-04

荧光蛋白作为一种分子标签，在细胞内蛋白质的定位以及动态示踪等方面有着广泛的应用。相较于其他分子标记，荧光蛋白更加易于和目的蛋白融合，对活细胞毒性小，应用更加便利。绿色荧光蛋白（GFP）是最早被发现的荧光蛋白，由日本著名化学家、海洋生物学家下村修从维多利亚水母中首次发现[1]。GFP通过一系列体外分子进化，发展出了多种荧光波长不同、发光强度更高的荧光蛋白，如EGFP（增强型绿色荧光蛋白）、BFP（蓝色荧光蛋白）、CFP（青色荧光蛋白）等[2]。这些荧光蛋白极大地丰富了相应的试验体系和技术，但由于这些荧光蛋白的发射波长均在440～529 nm[3]，容易激发胞内物质产生荧光，导致成像时背景较高，限制了这些荧光蛋白的应用。

1999年Matz等报道了第一个红色荧光蛋白DsRed（drFP583）[4]。DsRed自香菇珊瑚中分离得到，具有激发和发射波长较长、细胞内成像背景较低等优点，但在实际应用时常会以二聚体或四聚体形式出现，对组织、器官和细胞有一定的毒性，且在空间上限制了一些蛋白质的功能，从而影响了对目的蛋白的标记[5-7]。为解决DsRed的上述缺陷，在随后的研究过程中，Bevis等应用多种体外分子进化的手段，对DsRed进行了一系列的改造，最终得到了稳定地以单体形式存在的红色荧光蛋白mRFP[8-9]。mRFP有波长较长、半成熟时间较短、不易聚合等一系列优点，大大拓展了红色荧光蛋白的应用领域。Shaner等在mRFP的基础上，对其发色基团附近的位点进行突变，经过多轮突变、筛选、加帽加尾等过程得到了mHoneydew、mBanana、mOrange、mTangerine、mStrawberry及mCherry等一系列波长不同的单体红色荧光蛋白[10]。2017年，Bindels等以mCherry为模板，经过多轮突变改造得到了一个新的荧光蛋白mScarlet。这一新的单体红色荧光蛋白在发光强度、波长、荧光寿命等方面均有更优的性能[11]。

本研究拟通过构建荧光蛋白融合表达载体，将其转入原生质体过表达的方式，运用激光共聚焦显微技术来进行目的蛋白的胞内定位研究。笔者选用pUC18HE-mCherry和pUC18HE-mScarlet NT 2个不同的红色荧光蛋白表达载体，选取VTI12、RabD2a、ARA7以及SYP61[12]作为定位基因，来构建4个红色荧光蛋白融合表达载体。将构建好的红色荧光蛋白融合表达载体转入野生型拟南芥叶肉细胞原生质体中过表达，之后观察细胞中融合红色荧光表达蛋白的定位情况。

1材料与方法

1.1试验时间与地点

试验于2017年5—8月在西北农林科技大学生命科学学院郁飞实验室进行。

1.2材料

1.2.1植株、细菌和载体野生型拟南芥植株（Col-0），由西北农林科技大学生命科学学院贾敏博士提供;大肠杆菌TOPl0、紅色荧光蛋白融合表达载体pUC18HE-mCherry和pUC18-mScarlet NT，由西北农林科技大学生命科学学院植物分子遗传实验室保存。

1.2.2主要工具酶与试剂限制性内切酶、高保真DNA聚合酶、牛小肠碱性磷酸酶（CIAP）等均购自TaKaRa公司;T4 DNA连接酶购自Thermo Fisher科技（中国）有限公司;质粒提取试剂盒、琼脂糖凝胶电泳回收试剂盒均购自天根生化科技（北京）有限公司;金牌超量无内毒素质粒大提试剂盒购自康为世纪生物科技有限公司。

1.3方法

1.3.13种红色荧光蛋白的同源性比对

在美国国立生物技术信息中心（National Center for Biotechnology Information，简称NCBI）数据库中搜索出mRFP、 mCherry和mScarlet的DNA序列。将这3条DNA序列以Fasta格式输入至NCBI数据库中的ORFfinder，翻译为蛋白序列。将mRFP、mCherry和mScarlet的蛋白序列以Fasta格式输入EMBL数据库的程序Clustal Omega，之后再使用ExPasy上的Box Shade工具修饰所得数据，得到序列对比结果。对比结果中黑色部分代表这3个蛋白一级结构的相应位置上完全相同的氨基酸残基，灰色部分代表部分相同的氨基酸残基，consensus中星号（*）对应完全相同的氨基酸残基序列，点号（.）对应部分相同的氨基酸残基序列。

1.3.2融合表达载体的选取和构建选取VTI12、RabD2a、ARA7以及SYP61 4个定位基因来构建红色荧光蛋白融合表达载体。根据TAIR网站公布的拟南芥VTI12基因和RabD2a基因的序列设计引物扩增这2个基因的CDS（蛋白质编码区）序列，引物序列如表1所示。

表1中引物由北京六合华大基因科技有限公司合成。以野生型拟南芥cDNA为模板，分别用上述引物进行PCR扩增。将PCR产物进行回收后与融合红色荧光蛋白表达载体pUC18HE-mCherry分别用BamHⅠ和XhoⅠ双酶切，酶切时在载体中加入1 μL CIAP（牛小肠碱性磷酸酶，用于防止载体自连）;ARA7以及SYP61在笔者所在实验室前期工作中已经合成，故直接与表达载体pUC18-mScarlet NT分别用 BamHⅠ 和XhoⅠ双酶切即可。将酶切后的片段与载体用T4 DNA连接酶于22 ℃恒温器中反应2 h，将得到的连接产物与大肠杆菌TOPl0进行转化后涂布于抗性LB培养基上进行抗性筛选，利用碱性裂解法提取质粒进行酶切验证，将连接正确的质粒送至华大基因生物科技（深圳）有限公司进行序列测定。测定序列无误后，用金牌无内毒素质粒大提试剂盒提取质粒，以获得较高浓度的质粒（>1 mg/μL）。将得到的质粒保存于-20 ℃冰箱内。

1.3.3原生质体的制备与瞬时转化

首先配制酶解液：向酶解缓冲液中加入1% 纤维素酶R10和0.2%果胶酶R10，然后将酶解液于55 ℃水浴10 min，以促进纤维素酶和离析酶的溶解并且抑制蛋白酶的活性;待水浴后溶液冷却至室温，加入1%的1 mol/L CaCl2溶液、0.035%的β-巯基乙醇和0.1%的BSA（牛血清白蛋白）。将配制好的酶解液用0.45 μm滤膜过滤以除去溶液中的杂质。用锋利的小剪刀剪取3～4周龄的野生型拟南芥叶片，保留较长的叶柄，且选取平展嫩绿的叶片。将叶片用清水轻柔冲洗干净后用锋利的刀片切成约 1 mm 宽的细条，然后将切好的叶片浸没在适量酶解液中。于真空干燥罐中抽气30 min，使酶解液充分浸润叶片。随后在黑暗环境中 40 r/min 水平摇晃酶解混合液90 min，90 r/min水平摇晃 1 min 以释放酶解产生的球状原生质体，此时酶解液呈绿色。向酶解液中加入10 mL W5溶液（含154 mmol/L NaCl 9.0 g，125 mmol/L CaCl2 18.38 g，5 mmol/L KCl 0.372 g，2 mmol/L MES 0.42 g，用H2O定容至1 L。用 1 mol/L KOH调pH值至5.7，121 ℃高压灭菌20 min，4 ℃冷藏保存），轻柔摇晃后用35～75 μm的尼龙膜将酶解液过滤到圆底离心管中。4 ℃低温300 r/min水平离心5 min，除去上层清液后用10 mL冰预冷的W5溶液轻柔重悬管底细胞。如此再次重悬细胞1次后将混合液冰浴40 min。冰浴时可吸取少量细胞镜检，检查原生质体是否健康完整。冰浴后将细胞悬浮液于4 ℃低温 300 r/min 水平离心5 min，用适量MMg溶液（含0.4 mol/L甘露醇72.86 g，15 mmol/L MgCl2 3.05 g，4 mmol/L MES[2-（N-吗啡啉）乙磺酸]0.58 g，用H2O定容至1 L。用1 mol/L KOH调pH值至5.7，121 ℃高压灭菌20 min，4 ℃冷藏保存）重悬细胞。吸取200 μL悬浮液于 2 mL 离心管中，加入约30 μL（质粒浓度1 μg/μL）已制备好的质粒和230 μL的40% PEG（聚乙二醇）溶液，轻柔混匀后室温孵育25 min。之后加入800 μL W5溶液，轻柔混匀后于4 ℃低温 500 r/min 水平离心5 min，除去上层PEG混合液。加入1 mL W5溶液重悬细胞于6孔板中，置于22 ℃恒温培养基中 40 r/min 水平摇床上黑暗孵育8～16 h。孵育之后在激光共聚焦显微镜下观察红色荧光蛋白的表达。

2结果与分析

2.13种红色荧光蛋白的同源性比对及空间结构预测

由蛋白序列比对的结果（图1）可以看出mRFP、mCherry和mScarlet 3种红色荧光蛋白序列的分子体外进化过程，以及在体外分子进化的过程中，由mRFP到mCherry以及到mScarlet所进行的加帽、加尾和点突变等改造。

2.2融合表达载体的构建

2.2.1PCR扩增结果与酶切

在TAIR网站查找获得拟南芥VTI12基因和RabD2a基因的cDNA序列，以野生型拟南芥Col-0 cDNA为模板，用带有BamHⅠ和XhoⅠ酶切位点的引物，分别扩增出与预期669 bp大小吻合的条带以及与预期612 bp大小吻合的条带（图2）。

回收目的条带并将目的片段与融合红色荧光蛋白表达载体pUC18HE-mCherry均用BamHⅠ和XhoⅠ双酶切，酶切后产生约669 bp大小的VTI12的目的条带、约612 bp大小的RabD2a的目的条带以及4.7 kb大小的载体条带（图3），回收酶切片段。

将笔者所在实验室前期工作中已经合成的ARA7以及SYP61与融合红色荧光蛋白表达载体pUC18-mScarlet NT均用BamHⅠ和XhoⅠ双酶切，酶切后产生约603 bp大小的ARA7的目的条带、约738 bp大小的SYP61的目的条带以及4.5 kb大小的载体条带（图4），回收酶切片段。

2.2.2红色荧光蛋白融合表达载体的鉴定

将带黏性末端的目的片段与载体相连，取阳性克隆提取质粒，得到质粒后进行酶切验证（图5），酶切验证正确无误后进行测序，测序结果表明pUC18HE-NmCherry-VTI12、pUC18HE-NmCherry-RabD2a、pUC18-mScarlet NT-ARA7以及pUC18-mScarlet NT-SYP61等4個红色荧光蛋白融合表达载体构建成功。重组质粒基因结构如图6及图7所示。

2.3原生质体细胞瞬时表达红色荧光蛋白的结果

将上述构建好的4个红色荧光蛋白融合表达载体瞬时转化入已制备好的拟南芥叶肉细胞原生质体中进行过表达，之后[CM（25]进行共聚焦照相，得到的结果如图8所示。由图8可知，[CM（26]pUC18HE-NmCherry-VTI12、pUC18HE-NmCherry-RabD2a、pUC18-mScarlet NT-ARA7以及pUC18-mScarlet NT-SYP61均可在原生质体叶肉细胞中很好地表达。

3讨论

红色荧光蛋白作为一种分子标签，在蛋白质的细胞内定位等方面有着广阔的应用前景。与其他胞内蛋白质定位的方法[13]相比，构建红色荧光蛋白融合表达载体具有耗时短、易于观察目的蛋白、操作简便、不影响细胞活性等优点。本试验构建了4个红色荧光蛋白融合表达载体并在原生质体中瞬时表达，结果表明，pUC18HE-NmCherry-VTI12、pUC18HE-[JP3]NmCherry-RabD2a、pUC18-mScarlet NT-ARA7以及pUC18-mScarlet NT-SYP61等4个红色荧光蛋白融合表达载体都可以在拟南芥叶肉细胞原生质体中很好的表达，从而指示目的蛋白在细胞中的定位和分布。

参考文献：

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