一株拮抗茶炭疽病菌的木霉菌的分离、筛选及鉴定

赵兴丽，张金峰，周玉锋*，赵玳琳，张莉，周罗娜，陶刚*

一株拮抗茶炭疽病菌的木霉菌的分离、筛选及鉴定

赵兴丽1，张金峰2，周玉锋1*，赵玳琳3，张莉4，周罗娜1，陶刚3*

1. 贵州省农业科学院农业生物技术重点实验室，贵州 贵阳 550006；2. 贵州省农业科学院茶叶研究所，贵州 贵阳 550006；3. 贵州省农业科学院植物保护研究所，贵州 贵阳 550006；4. 贵州省农业科学院草业研究所，贵州 贵阳 550006

为获得对茶炭疽病有生物防治效果的拮抗木霉菌，本文采用梯度稀释法从茶树根际土壤中分离获得23株木霉菌，并通过平板对峙法和抑菌圈法从中筛选出1株强拮抗茶炭疽病菌的木霉菌株LS17110205。该菌株对茶炭疽病菌抑菌率达76.96%，并能在茶炭疽病菌菌落上产生大量白色菌丝及绿色分生孢子，使茶炭疽病菌菌落萎缩，颜色变暗；其发酵液也能有效抑制茶炭疽病菌菌丝生长，抑制率达70.08%。扫描电镜观察发现，菌株LS17110205发酵液能使茶炭疽菌菌丝表面皱缩。基于形态学特征结合分子系统发育树分析，将菌株LS17110205鉴定为。该研究结果为茶炭疽病的生物防治提供一定的理论基础。

根际土壤；抑菌率；茶炭疽病；鉴定；木霉菌

茶炭疽病是茶树主要病害之一，全国各地茶园均有发生，特别是在我国西南和华南茶区。该病主要由炭疽菌（s spp.）引起，病菌通常从嫩叶的背部侵入，然后萌发形成芽管侵入叶片组织[1]，在茶树成叶上显症，并影响茶树的生理代谢，使茶树出现大量落叶，严重时会导致植株枯死，直接影响茶树产量和茶叶品质[2-3]。目前，茶炭疽病的防治主要是以化学药剂为主，但过量使用药剂会引起农药残留和病原抗药性等问题。茶叶是一种直饮品，其安全性与我们的身体健康密切相关。由于人们对环境保护和食品安全问题的重视，传统化学防治方法所带来的弊端变得更加突出。

目前，以木霉菌（spp.）等生防微生物为主要成分的生防菌剂已经成为部分化学农药和化学肥料替代品和减量品[4-6]。木霉菌分布广泛[7]，存在于土壤、根围、叶片、种子和球茎等生态环境中[8]，营腐生生活。国内外相关文献报道显示，木霉菌对包括茶树病害在内的多种植物病害具有防治效果[9-11]，同时能够促进植物生长[12]。研究表明，在修剪后的茶树切口上施用木霉菌（和）制剂，可以有效抑制茶根腐病和茶枝梢黑点病的发生[13]。Onsando等[14]1994年的研究中发现、和对茶树根腐菌（spp.）具有较强的抑制作用；若在接种轮斑病菌前接种木霉菌，能显著抑制轮斑病菌（spp.）的侵染[15]。本研究通过收集茶树根际木霉菌资源，筛选拮抗木霉菌，并评价了菌株LS17110205对茶炭疽病菌的抑制效果，为茶树炭疽病的生物防治提供资源和理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 供试菌株

茶炭疽病菌（）为本实验室分离保存。茶炭疽病病样采自贵州省松桃县正大镇茶园，通过单孢分离技术获得纯化菌株，基于ITS序列和形态学特征将其鉴定为。

1.1.2 供试培养基

PDA培养基：土豆200 g、琼脂粉15~20 g、葡萄糖20 g、蒸馏水1 000 mL；PDB液体培养基：土豆200 g、葡萄糖20 g、蒸馏水1 000 mL；虎红酸钠培养基：土豆200 g、琼脂粉15~20 g、葡萄糖20 g、氯霉素0.3 g、虎红钠盐0.02 g、蒸馏水1 000 mL；丙酸钠培养基：土豆200 g、琼脂粉15~20 g、葡萄糖20 g、庆大霉素0.05 g、丙酸钠0.05 g、蒸馏水1 000 mL。

1.1.3 供试试剂及主要仪器

Ezup柱式真菌基因组DNA抽提试剂盒（上海生工生物工程股份有限公司），2×PCRMaster Mix酶[天根生化科技（北京）有限公司]。S-3400N扫描电子显微镜（日本日立公司）。

1.2 茶树根际木霉菌分离与筛选

1.2.1 梯度稀释法分离菌株

利用五点法从贵州省雷山县银球茶主产区采集茶树根际土。室温风干，混匀。称取10 g土样倒入装有90 mL灭菌蒸馏水的三角瓶中，150 r·min-1振荡30 min，使土样中的微生物充分混匀，得到10-1浓度的土壤悬液。在超净工作台中将10-1浓度的土壤悬液用灭菌蒸馏水逐一稀释成10-2、10-3和10-4的不同浓度。静置30 s，用移液枪分别取浓度为10-3和10-4的土壤悬液上清液100 μL滴于PDA平板上，用灭菌的涂布棒涂匀，28℃黑暗倒置培养至有菌落形成，取菌饼转接到新的PDA培养基上进行纯化，重复2次，采用硫酸纸袋进行–20℃低温冷冻保存。

1.2.2 平板对峙法初筛

用打孔器分别取茶炭疽病菌（）与待测木霉菌菌饼，直径为5 mm，将两菌饼接于同一PDA平板上，相距5.5 cm，每组5个重复，以单接茶炭疽病菌为对照，置于28℃培养，7 d后测量茶炭疽病菌朝向木霉菌的菌落半径，计算木霉菌的抑制率。同时统计木霉菌对茶炭疽病菌的覆盖率。通过对峙培养挑选对茶炭疽病菌的抑制率大于或等于70%且覆盖率为Ⅲ级的木霉菌株进行复筛。覆盖率分级标准参考陈书华等[16]的研究。

1.2.3 抑菌圈法复筛

无菌条件下取6个直径为5 mm的木霉菌菌饼接入PDB培养基中，28℃、200 r·min-1培养4 d，7 830 r·min-1、常温离心10 min，取上清液通过0.22 μm滤膜。按木霉菌发酵液∶PDA=1∶9的比例将木霉菌发酵液加入到PDA培养基中，混匀倒平板，取茶炭疽病菌菌饼接种于平板中央。25℃培养5 d，十字交叉法测量茶炭疽病菌菌落半径，计算其抑菌效果。

1.2.4 扫描电镜观察

利用扫描电镜观察木霉菌发酵液对茶炭疽病菌菌丝的影响，具体操作如下：

（1）样品前处理：打孔器取大小为5 mm×5 mm的茶炭疽病菌菌饼，放到2.5%戊二醛中，菌饼需完全淹没，放入4℃冰箱中过夜，进行固定；用0.1 mmol·L-1磷酸缓冲（PBS）洗涤3次，每次10~15 min；之后用浓度为55%、65%、75%、85%、95%以及100%叔丁醇对茶炭疽病菌菌饼进行梯度脱水，每个浓度约10~15 min，放入冷冻干燥仪，抽真空，进行冷冻干燥。

（2）镀金处理：利用导电胶把干燥后的菌饼粘于电镜样品放置的底座上，体视镜下用镊子将菌饼完全固定，洗耳球去除表面碎屑后，进行镀金处理。

1.3 菌株LS17110205的鉴定

1.3.1 形态特征观察

菌株LS17110205培养5 d后，挑取PDA平板上的菌落，制水玻片显微观察该木霉菌的形态特征并拍照。

1.3.2 基因组DNA提取、序列测定及系统发育树的构建

菌株LS17110205培养5 d后，用灭菌手术刀刮取菌丝及孢子，参照Ezup柱式真菌基因组DNA抽提试剂盒说明书提取菌株LS17110205的基因组DNA，采用引物：ITS1/ITS4（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG- 3′/5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）[17]进行PCR扩增。PCR反应体系（25 μL）：2×Master Mix 12.5 μL，DNA模板1 μL，引物各1 μL，ddH2O 9.5 μL，灭菌超纯水作为对照。PCR扩增程序分别为：94℃预变性5 min；94℃变性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸1 min，35个循环；72℃延伸10 min。通过1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物条带亮度后，委托上海生工公司进行序列测定，并将所测rDNA-ITS序列通过NCBI上的BLAST软件（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）进行同源性比较。BioEdit软件对测序序列和下载自NCBI-Gen Bank的序列进行多位点序列比对，并对其进行手动校正，校正后的序列采用MEGA 5.1软件将各基因序列按ITS→TEF的顺序首尾相连，保存为fast格式，再利用格式转换网站（http://www.sing-group.org/ALTER）将其转化为phy格式，并通过最大似然法分析构建最大似然树（Maximum likehood phylogenetic tree）[18]。

1.4 数据分析

数据采用Excel 2007和DPS 7.05软件进行方差分析，并通过LSD法比较各处理间的差异显著性（<0.05）。

2 结果与分析

2.1 茶树根际木霉菌分离及拮抗木霉菌的筛选

采用土壤梯度稀释涂布法从茶树根际土壤中分离纯化得到23株木霉菌。对峙培养初筛表明，23株木霉菌对茶炭疽病菌都有抑制作用（图1），其中有9株木霉菌对茶炭疽病菌的抑菌率大于70%且覆盖率为Ⅲ级（表1）。抑菌圈法复筛结果显示，茶炭疽病菌在含木霉菌发酵液的PDA平板上不能形成明显的抑菌圈。通过对9株木霉菌复筛后，发现其中4株木霉菌对茶炭疽病菌有抑制作用（表2）。

经初筛和复筛后，23株木霉菌中对茶炭疽病菌抑制效果最佳的为菌株LS17110205。结合表1和表2，菌株LS17110205对茶炭疽病菌的生长抑制率为76.96%，对峙培养5 d后该木霉菌菌丝覆盖茶炭疽病菌菌落的3/4以上，并在茶炭疽病菌菌落上产生大量白色菌丝，茶炭疽病菌菌落萎缩，颜色变暗（覆盖率为Ⅲ级）（图1），其发酵液对茶炭疽病菌具有较强的抑制效果，抑制率达70.08%。扫描电镜显微观察表明，与对照相比，菌株LS17110205的发酵液能使茶炭疽菌菌丝失水，表面呈褶皱状（图2）。

表1 拮抗木霉菌对茶炭疽病菌的抑制作用

注：表中数据为平均值±标准差，同列数据后不同小写字母表示差异显著（0.05）。下同

Note: The data are mean±SD. Lowercase letters in the same column mean significant difference (0.05). The same below

表2 木霉菌株发酵液对茶炭疽菌的抑制作用

图2 木霉菌株发酵液对茶炭疽菌菌丝的影响

2.2 木霉菌株LS17110205的种类鉴定

2.2.1 培养特性及形态学特征描述

在PDA培养基上培养5 d后，菌株LS17110205平板正面形成绿色菌落，平板背面呈现为绿色，无色素和特殊气味产生，菌落日均生长速度约为3.8 cm·d-1，有大量气生菌丝产生，有同心轮纹，菌落绒毛状至毡状，平板边缘形成绿色产孢区。分生孢子簇棉絮状，有单个分生孢子梗分枝，直径约为6.99 μm；分生孢子梗上的瓶梗呈对称分布，安瓿形，直径约为5.19 μm；分生孢子球形至亚球形或不规则性，光滑、淡绿色，大小为(4.67~5.97) μm ×(5.03~8.56) μm（图3）。根据菌株LS17110205的培养特性和形态学特征，初步确定其分类地位为[19-22]。

2.2.2 序列测定及多基因系统发育学分析

木霉菌株LS17110205的rDNA-ITS基因序列GenBank数据库登录号为MK421515。测序结果经BLAST同源性比对的结果与下载至GenBank的部分木霉菌的ITS及TEF序列（表3）进行分子系统发育学分析，选择作为外群，构建木霉菌的分子系统发育树，结果表明菌株LS17110205和聚为同一分支（图4），且具有较高的支持率，结合菌株LS17110205的形态学特征[23-25]，将该菌株鉴定为。

3 讨论

茶炭疽病的发生与流行受气候、管理和品种抗性等因素的影响，高温高湿的环境适宜茶炭疽菌的生长与繁殖。研究表明，茶炭疽菌分生孢子可以附着在叶表面存活5个月左右[26]，茶炭疽菌分生孢子在土壤及植物组织中的长期存活会使得茶炭疽病连年发生和扩散，给茶农造成重大的经济损失。目前，对茶炭疽病的防治主要采用化学杀菌剂，但化学农药的过量和不合理的使用会造成农药残留等问题，直接影响人们的身体健康和生活环境，解决这个问题关键是生物防治等绿色防控技术的应用。

利用生防菌研制的生防制剂来防治茶树炭疽病是一种绿色、安全、有效的途径。国内外已报道的生防菌很多，主要包括放线菌[27]、枯草芽孢杆菌[28]以及木霉菌[29]等。近年研究表明，木霉菌是一种重要的生防真菌，其生防机制主要包括：竞争营养和定殖位点、抗生作用、重寄生作用及诱导植物抗性等作用[30]。如冯俊清[31]等用还原糖法测定了钩状木霉（）不同发酵时间几丁质酶活力的变化，结果表明，几丁质酶活性在45 h达到最大，用电子显微镜观察发现不同发酵时间的木霉菌都能降解和破坏辣椒白绢病致病菌的菌丝，并推断木霉菌生防作用的重要机制是产生了几丁质酶。而Hanhong等[32]研究发现木霉菌可诱导植株产生防御体系从而延缓辣椒疫病（）发生。随着研究深入，生防木霉菌正不断被发现，如姬承东等[33]通过分离和筛选获得2株强拮抗木霉菌：加纳木霉（）GCPL175和木霉菌株GCPL12，它们的发酵液的无菌滤液对环柄菇属菌（spp.）1506的抑菌率分别达61.23%和73.13%；且其防控方法也在不断改进，如刘明鑫等[34]通过变换立枯丝核菌（）和棘孢木霉菌（）437的施用顺序发现，木霉菌和病原菌在同时施用时对枯萎病的防效最高。为了使木霉菌能够有效的应用到茶树病害绿色防控上，本研究立足茶园生境，将来自茶树根际土壤中的木霉菌资源，通过初筛和复筛从中筛选获得具有生防潜能的木霉菌株LS17110205，该菌株对茶炭疽病菌具有显著的抑制作用，具有较强的开发潜能；此外还发现该木霉菌株的发酵液能够使茶炭疽病菌菌丝失水皱缩，具体原因有待下一步研究。

注：A、B菌落正反面；C、H—J分生孢子梗；D、E菌丝周围聚集大量分生孢子；F、G分生孢子簇；K、L分生孢子上的附着胞；M—S分生孢子

表3 用于系统发育分析的真菌的种名、菌株号及GenBank登录号

图4 菌株LS17110205与相关种的系统发育树

近几年，随着生物技术的发展与应用，多基因系统进化分析在木霉菌分类研究中得到广泛应用[35-36]，木霉属内组、种之间的关系发生了较大的变化[37-38]。为了明确生防木霉菌LS17110205的分类地位，研究结合形态学特征和多基因系统进化分析，将菌株LS17110205鉴定为。

研究结果为木霉菌株LS17110205拮抗茶炭疽病菌的机制研究和木霉菌菌剂的开发利用提供前提和重要的理论基础。

致谢：本文在木霉菌分离方法技术方面得到中国农业科学院农业资源与农业区划研究所顾金刚老师的帮助，特此感谢!

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Isolation, Screening and Identification of A Strain ofAntagonizing Tea Anthracnose

ZHAO Xingli1, ZHANG Jinfeng2, ZHOU Yufeng1*, ZHAO Dailin3,ZHANG Li4, ZHOU Luona1, TAO Gang3*

1. Guizhou Academy of Agricultural Sciences key laboatory of agricultural biotechnology, Guiyang 550006, China; 2. Guizhou Academy of Agricultural Sciences tea research institute, Guiyang 550006, China; 3. Guizhou Academy of Agricultural Sciences institute of Plant Protection, Guiyang 550006, China; 4. Guizhou Academy of Agricultural Sciences grass industry research institute, Guiyang 550006, China

To obtain antagonisticfor biocontrol of tea anthracnose, the twenty-threestrains were isolated fromrhizosphere-soil by taking gradient dilution. Among them, the strain LS17110205 against tea anthracnose was screened by using dual-culture and inhibition zone assay.The results show that the inhibitory rate of LS17110205 against tea anthracnose was up to 76.96% and a large number of white hyphae and green spores were produced on the colony of tea anthracnose, which caused the tea anthracnose colony to shrink and became dark. The fermentation liquid of LS17110205 was effective against pathogenhyphae, and the inhibitory rate was70.08%. The results show that the fermentation of the strain LS17110205 caused the tea anthracnose mycelia to shrink on the surface by scanning electron microscope analysis. LS17110205 was identified ason the basis of the morphological characteristicsand phylogenetic tree. The results provided theoretical basis in biocontrol of tea anthracnose.

rhizosphere-soil, inhibitory rate, tea anthracnose, identification,spp.

S571.1；S435.711

A

1000-369X(2019)04-431-09

2018-12-06

2019-02-13

国家现代农业（茶叶）产业技术体系建设专项资金项目（CARS-19）、国家重点研发计划项目子课题（2016YFD0200906、2017YFD0201102）、黔科合平台人才[2017]5717号、黔农科院自主创新科研专项字[2014]009号

赵兴丽，女，硕士，主要从事植物真菌病害的防治方面的研究。*通信作者：gzzhouyf@163.com，ttg729@sina.com