MiR-206在梅山猪卵巢中的表达及其靶基因的生物学信息分析

褚颜姣

摘 要 本研究探讨miRNA-206在梅山猪不同直径卵巢中的表达，利用Targetscan 6.2进行靶基因的预测，得出其靶基因总数为588个，主要有抗药蛋白、溶血磷脂酸受体5、冠蛋白与肌动蛋白结合蛋白等，利用DAVID 数据库，进行KEGG 信号转导通路富集分析，采用Cytoscape3.0及其插件KEGGscape插件，获得靶基因功能富集通路图。结果表明：其靶基因功能富集在细胞通讯连接、定位调控、刺激反应和发育过程等生物学功能，蛋白结合、结合酶、核酸结合等分子功能，细胞连接和核控等细胞组分；KEGG通路则显著富集于蛋白定位、蛋白转移等信号通路中。

关键词； miR-206； 卵巢；生物学信息；梅山猪

微小RNA是一类非编码、内源性的短小RNA，存在于真核细胞当中，具有组织特异性或发育阶段特异性表达特征，其作用机制是通过与靶mRNA 的3′端非翻译区（UTR）完全或不完全配对从而降解靶mRNA 或抑制mRNA 的正常翻译， 进而对基因转录后表达进行调控。卵巢是动物体内重要的生殖器官之一，对动物生殖调控过程具有重要影响。本研究关注miR-206在卵巢中的表达将对分子水平的人类配子的发育机制有更清晰的认识，同时也将为生殖医学发展提供新动力。[1]

1 材料与方法

1.1 梅山猪卵巢卵泡获取

从梅山猪保种基地获取成年梅山猪卵巢，应用40℃ PBS漂洗，依据卵泡大小进行分类，将获得的卵泡存放于-80℃冰箱冻存，待用。

1.2 卵泡总RNA提取

（1） 将lml的Trizol加入lml离心管中。

（2） 各取300-500mg不同直径卵泡置入低温下的陶瓷碾碾成粉末，将粉末迅速转入上述离心管中，混合均匀。

（3） 加入0.2ml氯仿，盖紧，剧烈震荡30s，室温下放置5min。

（4） 4℃、12000r/min离心10min后，取上层水相溶液，转入新离心管中，避免接触下两层液体。

（5） 在得到的上清液中加入等体积的异丙醇混匀，冰上放置 15min。

（6） 将所得溶液，4℃、12000rpm离心10 min，离心后管底及侧壁有RNA沉淀。

（7） 移去上清液，用1ml、75%乙醇清洗 RNA沉淀，震荡 30s，4℃、12000rpm离心 2min，弃上清。

（8） 快速离心1min，去除残余液体，RNA沉于管底。

（9） 室温放置超净台风干10分钟，将沉淀物晾干后溶于20μl DEPC水中，-80℃保存。

1.3 RNA浓度、纯度和完整性的测定

取样检测 RNA 浓度，将取提后总 RNA稀释 20 倍，紫外分光光度计，测定参数设定为 RNA，在比色皿中加入 100ul 的RNase-free ddH2O 校正调零，检测样本OD260/280 比值及浓度。

1.4 miR-206荧光定量PCR

1.4.1合成cDNA

Total RNA 1.0ug 无RNA酶水至20ul， 总体积20ul。

（1） 冰上预冷的RNase free的离心管，准备RT master mix；

（2） 混匀上述溶液，2000rpm离心2min；

（3） 摇匀，冰上放置5min；

（4）反转录反应条件，16℃，30min；42℃，42min；85℃，5min；将以上产物放在冰上待用或-20℃保存。

1.4.2 实时荧光定量PCR

所有cDNA样品分别配制实时荧光定量PCR反应体系；

轻弹管底将溶液混合，5000 rpm 短暂离心，将 PCR 反应溶液置于 Real-time PCR 仪上进行 PCR 反应。[2]

1.5 miR-206靶基因预测

将获得的猪miR-206，利用Targetscan 6.2进行靶基因预测，得到有关miRNA-206的靶基因总数。

1.6 miR-206生殖相关靶基因 Gene Ontology 分析

Gene Ontology分析利用Cytoscape 3.0及其插件BiNGO ，从而对靶基因进行功能富集分析。根据GO 注释中的分子功能 、生物学过程、细胞组分等应用选项，用BiNGO 进行相应GO注释显著性分析。

1.7 KEGG 通路分析及KEGG通路图

针对预测出的miR-206的生殖相关靶基因，利用DAVID 数据库进行KEGG 信号转导通路富集分析，采用Cytoscape 及其插件KEGGscape插件获得靶基因功能富集通路图。

1.8 统计学分析

应用SPSS 18.0软件包对数据进行统计分析，使用ANOVA检验对GO分析及KEGG通路分析中数据间差异进行比较。

2 结果

2.1 miR-206在梅山猪卵巢中的表达

miR-206在不同直径的卵巢中表达存在差异，在直径为1.5-3mm的卵巢中相对表达量差异不显著，在直径为3-5mm的卵巢中相对表达量差异显著，在直径≥5mm的卵巢中相对表达量极显著。

2.2 miR-206靶基因预测

结果显示，miR-206的靶基因数共588个基因，主要有抗药蛋白、溶血磷脂酸受体5、冠蛋白与肌动蛋白结合蛋白等。

2.3 miR-206 生殖相关靶基因Gene Ontology 分析

将上述miR-206与生殖有关的靶基因输入到Cytoscape 3.0及其插件BiNGO中，GO注释miR-206与生殖有关的靶基因涉及到的生物學过程，结果表明：其靶基因功能富集在细胞通讯连接、定位调控、刺激反应和发育过程等生物学功能，蛋白结合、结合酶、核酸结合等分子功能，细胞连接和核控等细胞组分。

2.4 KEGG 通路分析及KEGG通路图

对与miR-206生殖有关的靶基因进行KEGG 通路分析，结果显示，靶基因富集于蛋白定位、蛋白转移等相关通路。

3 讨论

本研究探讨了MiR-206在不同直径卵巢中的表达，研究所得出的结果显示了miR-206在卵巢中的作用，这对于进一步研究miR-206与卵巢功能的关系具有重要的现实意义，帮助人们更好的理解了哺乳动物生殖内分泌调控机制，为提高哺乳动物繁殖力和探寻更科学的生殖调控途径提供了新的依据。

参考文献：

[1]钟凯、王月影、朱河水.microRNA在调节乳腺发育和乳腺免疫功能中的作用[J]. 江西农业学报，2012，24（5）：164-166

[2] CroceC M， Calin G A， miRNAs， cancer， and stem cell division[J]. cell，2005，122（1）：6-7