碳酸酐酶Ⅲ与老年2型糖尿病性血管病变的相关性分析

于钟钰， 张晓明， 王剑涛， 温小红， 徐晓蝶， 郭景春， 周厚广*

1. 复旦大学附属华山医院老年医学科，国家老年疾病临床医学研究中心，上海 200040 2. 复旦大学神经生物学国家重点实验室，上海 200032

近年来，随着经济水平和人们预期寿命的不断提高，中国已进入了人口老龄化的加速期。近期发布的《老年健康蓝皮书：中国老年健康研究报告(2018)》显示，2000至2018年，我国60岁及以上老年人口从1.26亿人增加到2.49亿人，占总人口比重从10.2%上升到17.9%。老龄化的加剧导致心脑血管疾病的发病率显著升高[1-2]，而老年人心脑血管病变的病理基础主要是动脉粥样硬化。发生动脉粥样硬化的危险因素众多[3-6]，如2型糖尿病(type 2 diabetes，T2DM)、高血压病、血脂异常、肥胖、高同型半胱氨酸等，其中T2DM是最重要的独立危险因素。T2DM患者体内存在糖脂代谢紊乱、胰岛素抵抗和炎症反应，这些刺激可引起动脉粥样硬化，促进血管病变的发生发展[7]。

研究[8]表明，氧化应激反应是动脉粥样硬化发生过程中的关键步骤。碳酸酐酶(carbonic anhydrase，CA)是一种广泛存在的含锌金属蛋白酶，同时也是一种pH调节蛋白，其中CAⅢ是该家族的特殊成员[9]。CAⅢ在人体的骨骼肌和肝脏组织中表达丰富，且可以保护细胞免受氧化应激的损伤[10-11]。因此，本研究拟进一步探讨血清CAⅢ水平与老年T2DM患者血管并发症的相关性，为老年人T2DM性血管病变的诊断提供参考。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2017年复旦大学附属华山医院老年病科体检人员，详细询问并记录所有入组者年龄、性别、既往病史等。既往史包括：有无高血压病、T2DM、冠心病、高血脂、心绞痛、心肌梗死、脑卒中、短暂性脑缺血发作等。根据2010年版美国糖尿病学会(ADA)糖尿病诊断标准筛选符合标准的T2DM患者，共246例。记录患者有无血管性疾病，包括脑血管疾病(脑梗死/脑小血管病/脑出血等)、冠心病、颈动脉粥样硬化。据此，将T2DM患者分为有血管并发症组(n=87)和无血管并发症组(n=159)。筛选同期56例健康老年人作为对照组。因此，本研究共有3组研究对象：对照组、T2DM未合并血管并发症组和T2DM合并血管并发症组。

排除标准：T2DM以外的其他类型糖尿病患者或继发性糖尿病患者；T2DM合并急性并发症，如酮症酸中毒、高渗性昏迷、低血糖；合并其他内分泌代谢疾病，如甲状腺功能亢进或减退、肾上腺皮质功能不全、垂体瘤等；免疫相关血管性疾病；自身免疫性疾病、急慢性感染、艾滋病、梅毒、肝硬化、肾功能衰竭、恶性肿瘤、围手术期、有精神病史等患者。对照组入组标准：无上述常见老年慢性疾病，同时无以上排除标准中各种疾病。本研究通过复旦大学附属华山医院伦理委员会审核批准。

1.2 研究方法 比较对照组和T2DM组患者的血清生化指标。比较T2DM是否伴发血管并发症两组患者的基本数据(包括年龄、高血压、高脂血症、心房颤动/房扑、左束支传导阻滞)以及血清标志物水平。为研究血清CAⅢ水平与T2DM合并血管并发症间是否存在相关性，ELISA法检测3组患者血清CAⅢ水平，采用Spearman相关系数分析CAⅢ水平与血清生化指标之间的相关性，同时采用ROC曲线评价血清CAⅢ水平对诊断T2DM血管并发症的临床应用价值。

1.3 生化指标 受检者清晨空腹(至少8 h内未进食)，采集静脉血5 mL，生化指标检测采用全自动生化分析仪，包括谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、谷氨酰转移酶(GGT)、碱性磷酸酶(ALP)、总胆红素(TBIL)、直接胆红素(DBIL)、总蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、尿素氮(BUN)、肌酐(Scr)、尿酸(UA)、胆固醇(TC)、三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白(LDL)、高密度脂蛋白(HDL)、空腹血糖(FBG)、糖化血红蛋白(HbA1c)，检测严格遵守《全国临床检验操作规范》规定。

1.4 血清CAⅢ水平检测 收集3组受检者的血清。采用ELISA试剂盒检测各组血清中CAⅢ水平。首先在试剂盒中取标准品1支，离心机中使用6 000 r/min离心30 s，然后用1 mL样本稀释液溶解，完全混匀后得标准品S7。标记7个1.5 mL离心管依次排列，编号为S0～6，每个离心管中加入250 μL样本稀释液，然后吸取250 μL S7内标准品，放入第一个离心管S6中，将S6混匀后吸取出250 μL溶液放入第2个离心管S5中，如此依次进行标准品的稀释，S0离心管中加入样本稀释液。依照以上步骤将标准品稀释为500、250、125、62.5、31.2、15.6、7.8、0 ng/mL。然后，标记标准品孔和待测样本孔，每孔中分别加入标准品或待测样本100 μL,混匀后盖上板贴，使用37℃温箱孵育2 h。弃去液体，甩干。加入生物素标记抗体工作液100 μL，盖上板贴，37℃温箱孵育1 h。弃去液体，甩干，洗板2 min×3次，每孔200 μL，甩干。加入辣根过氧化物酶标记亲和素液100 μL，盖上板贴，37℃温箱孵育1 h。弃去液体，甩干，洗板2 min×5次，每孔200 μL，甩干。每孔内加入90 μL底物溶液，37℃避光显色15～30 min。之后，每孔加入50 μL终止溶液，使反应终止。检测450 nm波长的光密度(D)值。最后，利用标准曲线计算出各个样品中的CAⅢ水平。

2 结 果

2.1 一般资料的比较 结果(表1)表明，与对照组相比，T2DM组患者血清中ALT、TP、ALB、BUN、UA、TG、LDL、FBG、HbA1c水平均增加，同时血清中HDL水平降低，差异有统计学意义。结果表明，T2DM患者体内普遍存在糖脂稳态失衡。本研究中，T2DM患者中血管并发症的发生率为35.37%，其中冠心病的发生率最高，为28.86%；合并脑血管疾病的发生率为11.38%；合并颈动脉粥样硬化的发生率为4.47%。

2.2 有/无血管并发症T2DM患者间的基本资料和生化指标比较 结果(表2)表明，与无血管并发症组相比，有血管并发症组的高血压、高脂血症、心房颤动/房扑以及左束支传导阻滞的发生比例较高，且年龄和高血压两因素差异具有统计学意义(P<0.05)。结果表明，T2DM伴血管并发症患者患有高血压、高脂血症、心房颤动/房扑、左束支传导阻滞的概率较大，远期并发症风险较高。

表1 对照组和T2DM组患者生化指标比较

*P<0.05，**P<0.01. 谷丙转氨酶(ALT)；谷草转氨酶(AST)；谷氨酰转移酶(GGT)；碱性磷酸酶(ALP)；总胆红素(TBIL)；直接胆红素(DBIL)；总蛋白(TP)；白蛋白(ALB)；尿素氮(BUN)；肌酐(Scr)；尿酸(UA)；胆固醇(TC)；三酰甘油(TG)；低密度脂蛋白(LDL)；高密度脂蛋白(HDL)；空腹血糖(FBG)；糖化血红蛋白(HbA1c)

血清生化指标的检测结果(表3)表明：与无血管并发症组相比，有血管并发症组患者的血清TBIL水平较低，差异具有统计学意义(P<0.05)，但其余生化指标均无显著性差异。T2DM患者体内普遍存在糖脂稳态失衡，各种血清生化指标均可出现异常，但目前常见的血清生化指标并不能用来评估T2DM患者有无血管并发症。

表2 有/无血管并发症T2DM患者间基本资料比较 n(%)

表3 有/无血管并发症T2DM患者间血清生化指标(95%CI)的比较

谷丙转氨酶(ALT)；谷草转氨酶(AST)；谷氨酰转移酶(GGT)；碱性磷酸酶(ALP)；总胆红素(TBIL)；直接胆红素(DBIL)；总蛋白(TP)；白蛋白(ALB)；尿素氮(BUN)；肌酐(Scr)；尿酸(UA)；胆固醇(TC)；三酰甘油(TG)；低密度脂蛋白(LDL)；高密度脂蛋白(HDL)；空腹血糖(FBG)；糖化血红蛋白(HbA1c)

2.3 不同组别血清CAⅢ水平的比较 ELISA法分别检测了3组人群血清中CAⅢ水平(图1)，结果提示，3组间CAⅢ水平差异有统计学意义，其中，与对照组(1.05±0.108)相比，两个T2DM组血清CAⅢ水平均明显降低(P<0.01)。同时，T2DM合并血管并发症组血清CAⅢ水平(0.82±0.113)显著低于T2DM未合并血管并发症组(0.97±0.131，P<0.01)。

2.4 血清CAⅢ水平与各生化指标之间相关性分析 结果(表4)表明，血清CAⅢ水平与HDL和TBIL正相关，而与LDL和Scr负相关，但均无显著统计学差异，不排除样本量较小所致可能。血清CAⅢ水平与BUN、FBG、HbA1c负相关，差异有明显统计学意义(P<0.05)，提示血清CAⅢ水平与BUN、FBG和HbA1c间的关联性较大。

图1 3组患者血清CAⅢ水平的比较

**P<0.01，T2DM未合并血管并发症组/T2DM合并血管并发症组与对照组相比；&&P<0.01，T2DM未合并血管并发症组与T2DM合并血管并发症组相比

表4 血清CAⅢ水平与各生化指标之间Spearman相关性分析

HDL：高密度脂蛋白；LDL：低密度脂蛋白；TBIL:总胆红素;Scr：肌酐；FBG：空腹血糖；HbA1c：糖化血红蛋白

2.5 血清CAⅢ水平对诊断T2DM合并血管并发症的临床应用价值 通过比较ROC曲线(图2)下面积AUC大小判断各指标对T2DM合并血管并发症的临床诊断准确性。分析结果(表5)显示，LDL的AUC为0.507 8(95%CI 0.390 9～0.624 6，P=0.896 9)，HDL的AUC为0.531 7(95%CI 0.423 2～0.640 3，P=0.566 0)，TBIL的AUC为0.557 3(95%CI 0.451 5～0.663，P=0.291 8)，CAⅢ的AUC为0.884 6(95%CI 0.813 2～0.956，P<0.000 1)。结果(表5)显示，血清CAⅢ的ROC曲线下面积AUC为0.884 6，诊断准确性优于其他3项常规指标，提示血清CAⅢ对T2DM合并血管并发症具有较好的临床诊断敏感性和特异性。

图2 各生化指标的ROC曲线

项目AUC面积约登指数灵敏度(%)特异度(%)LDL0.507 823.6423.64100HDL0.531 715.6128.5787.04TBIL0.557 313.5592.8620.69CAⅢ0.884 669.5483.3386.21

3 讨 论

伴随着我国进入深度老龄化社会，心脑血管疾病已严重威胁老年人群的身体健康和生活质量。动脉粥样硬化是老年人心脑血管疾病的主要病理基础。T2DM、高血压病、高脂血症、吸烟、肥胖和非酒精性脂肪肝等是动脉粥样硬化的常见危险因素，其他还包括高尿酸血症、高同型半胱氨酸血症、不健康的饮食习惯、家族史等。中国T2DM的发病率逐年增加，是老年人群中最常见的慢性疾病，同时T2DM引起的血管病变严重影响老年人的预期寿命。虽然以往相关研究认为T2DM引起的动脉粥样硬化病变过程中有氧化应激、炎症反应、内皮细胞功能障碍等多种相关机制的参与其中，但具体分子机制尚未完全明确。本研究发现，无论T2DM患者有无血管并发症，体内CAⅢ水平与对照组相比均显著降低，同时T2DM合并血管并发症患者血清中CAⅢ水平低于T2DM未合并血管并发症患者，提示血清CAⅢ水平可能与T2DM及其相关血管并发症的发生发展存在内在联系。

T2DM患者体内长期存在高血糖和胰岛素抵抗，在多种代谢紊乱的病理生理因素刺激下，通过增强氧化应激，引起血管内皮损伤，炎症因子和黏附分子表达增加，致炎细胞向动脉内膜迁移并黏附。血管内巨噬细胞通过吞噬LDL，形成泡沫细胞，最终促进动脉粥样硬化的发生发展[12]。研究表明，在氧化应激状态下肝细胞内CAⅢ表面的两个半胱氨酸残基会迅速结合形成S-谷胱甘肽[13]；暴露在H2O2的细胞转染CAⅢ后，活性氧(ROS)水平较未转染组明显减少[14]，提示CAⅢ可能具有抗氧化应激作用。在本临床试验中，T2DM合并血管并发症患者血清CAⅢ水平明显低于对照组和T2DM未合并血管并发症组，提示CAⅢ水平下降有可能参与了T2DM患者体内的氧化应激，从而促进了动脉粥样硬化的发生发展进程。同时，除了作为一个特殊的体内抗氧化应激因子，CAⅢ还是一种pH敏感型的蛋白酶，在胰岛素抵抗和高血糖作用下，可造成细胞内乳酸生成增多，pH值下降，进而抑制CAⅢ的表达，同时抑制O2与血红蛋白结合，导致HbA1c增多，氧合血红蛋白减少[15]，使组织出现缺氧，导致氧化应激反应增强，引起血管内皮损伤，进而诱导动脉粥样硬化的进展。

此外，T2DM患者常伴随肥胖和高脂血症，血液中LDL水平增高和HDL水平降低会增加泡沫细胞的形成[16]，引起血液黏度增加和血流动力学变化，进而损伤动脉管壁，加速动脉粥样硬化的发展进程[17]。以往相关研究表明，胰岛素可促进脂肪组织的从头合成，而CAⅢ则主要是为此过程提供碳酸氢根离子[18-19]。T2DM患者体内CAⅢ水平低下可能会加重脂代谢紊乱，从而导致血管并发症的发展。本研究发现，与56例正常老年对照组相比，248例老年T2DM患者血液中LDL水平明显增高，而HDL水平则显著降低，提示临床老年T2DM患者确实存在明显的脂代谢紊乱，与上述报道结果基本一致。

本研究中Spearman相关性分析显示血清中TBIL水平与CAⅢ正相关，而且TBIL水平在T2DM有无血管并发症患者中存在明显差异，即合并血管并发症T2DM患者的TBIL水平明显低于无血管并发症T2DM患者。临床上普遍认为胆红素作为一种有害物质，主要用来评估肝功能和黄疸。其实胆红素同时也是一种内源性抗氧化剂[20]，可以参与抗氧化、抗炎症、抑制细胞凋亡、改善氧化应激等的生理反应[21]。研究表明缺血性脑卒中患者血清胆红素水平偏低，而相对较高的胆红素水平可能有助于避免脑梗死的发生[22]。因此，血清总胆红素水平过低有可能是诱发老年人血管病变的危险因素之一。由于血清CAⅢ和TBIL水平均与机体氧化应激水平相关，提示两者之间可能存在一定的内在联系，共同参与T2DM相关氧化应激障碍和血管并发症的发生发展进程，适当提升或补充CAⅢ和TBIL水平可能有助于预防或延缓T2DM相关血管并发症。但其内在机制尚待进一步研究和明确。

本研究还发现，血清CAⅢ水平还与BUN和Scr呈一定负相关性，并与BUN呈显著负相关，提示血清CAⅢ水平与BUN等肾功能相关指标存在一定内在关联性。长期高血糖可造成肾脏血流动力学紊乱和葡萄糖代谢异常，激活机体内氧化应激反应[23-24]，而CAⅢ水平适度升高可使细胞免受氧化应激损伤[25]，同时氧化应激反应可增强CAⅢ蛋白质氧化，氧化的蛋白质随之被泛素化而降解。因此，我们推测肾功能水平可影响血清CAⅢ水平，而适度提升CAⅢ水平和活性可能有助于在一定程度上保护肾功能。

综上所述，老年T2DM患者血清CAⅢ水平与糖脂代谢稳态之间存在密切相关性，并与肾功能和TBIL水平存在一定内在联系。ROC曲线分析提示血清CAⅢ水平与T2DM血管并发症之间存在内在关系，对T2DM合并血管并发症具有良好的临床诊断参考价值。结果提示血清CAⅢ可能是通过调控糖脂代谢稳态等机制来发挥其重要的生物学效应，低水平的血清CAⅢ可能与TBIL共同参与了T2DM相关氧化应激和血管并发症的发生发展进程。适度提升或补充CAⅢ可能有助于预防或延缓老年T2DM相关血管并发症的发生发展。但目前上述作用机制尚不清楚，仍需大量临床观察和深入研究来阐明和揭示CAⅢ参与老年T2DM性血管病变的病理和分子机制，进而为老年T2DM性血管并发症的机制研究和临床干预提供新的思路。