左氧氟沙星联合头孢哌酮/舒巴坦对耐碳青霉烯类鲍曼不动杆菌防耐药突变浓度的影响＊

张欣悦，边锋芝，柳春梅，杨 菁，张华金，宫 英，孙成春

鲍曼不动杆菌为非发酵革兰阴性杆菌，是医院ICU、神经外科及呼吸科患者发生肺部感染致死的主要因素［1］。近年来，随着各种广谱抗生素的滥用，鲍曼不动杆菌的耐药情况日益严重，使其成为医院感染最严重的病原菌之一。由于碳青霉烯类药物在治疗鲍曼不动杆菌感染的出色表现，使其应用范围和频率加快，直接导致院内耐碳青霉烯类鲍曼不动杆菌 （Carbapenem-resistant Acinetobacter baumannii，CRAB）感染率呈上升趋势。一旦感染CRAB，常发生定植感染而不易根治，给临床治疗带来极大挑战［2，3］。

Drlica等［4］基于对耐药菌的深入研究，创造性地提出防突变浓度 （mutant prevention concentration，MPC）和突变选择窗（mutant selection window，MSW）理论，成为近年来临床有效抑制细菌耐药及制定应对策略的参考依据和该领域的研究热点。MPC是评价抗菌药物防耐药能力的新指标，特指防止耐药突变菌株被选择性富集扩增所需的最低抗菌浓度。MSW是指最低抑菌浓度（MIC）到MPC之间的范围。基于该理论的阐述，当两种或两种以上药物联合应用时，细菌需要同时突变两次或多次才能产生突变菌株。由于细菌连续突变两次以上的概率极低，从而使MSW缩小或关闭。目前关于LVX联合CFS对CRAB的MPC的影响研究少有报道。该研究通过体外LVX联合CFS对CRAB的MPC影响，探讨抗菌药物联用与MPC、MSW的规律，为临床合理应用抗生素提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 抗菌药物与培养基LVX注射液（0.1 g/支，批号：18052631，扬子江药业集团有限公司）；注射用CFS（2.0 g/支，批号：16011507，深圳立健药业有限公司）。M-H琼脂平板培养基 （环凯微生物科技），M-H肉汤粉（英国Oxiod公司）。

1.2 菌株来源与鉴定选择笔者所在医院2017年1月—2017年 12月临床标本中分离的60株CRAB。鲍曼不动杆菌标准菌株ATCC19606购于中国食品药品鉴定研究院；质控菌为铜绿假单胞菌ATCC27853和大肠埃希菌ATCC25922，均购自济南奥克赛生物技术有限公司。经VITEK-2分析仪鉴定，采用纸片扩散法（Kirby-Bauer法）进行药敏试验，选取对亚胺培南或美罗培南耐药的鲍曼不动杆菌60株。

1.3 实验仪器电热恒温培养箱（常州杰博森仪器有限公司）；Vitek比浊仪 （法国生物梅里埃公司）；XK 96-3型微量振荡器（江苏大唐医疗器械有限公司）；VITEK-2全自动微生物分析仪（法国生物梅里埃公司）；DW-HL528型超低温冰箱（中科美菱低温科技股份有限公司）。

1.4 最低抑菌浓度的测定

1.4.1 单独用药时MIC的测定 采用微量肉汤稀释法，测定LVX和CFS单独应用时的MIC，并按美国临床实验室标准化协会（CLSI）2015 年标准［5］判读结果。

1.4.2 测定LVX和CFS联合应用时的MIC 采用简化棋盘法［6］测定LVX和CFS联用时的MIC。

1.4.3 FIC指数的计算及判定标准 FIC指数=MIC甲药联用/MIC甲药单用+MIC乙药联用/MIC乙药单用。 判定标准：FIC 指数≤0.5，协同作用；0.5～1，相加作用；1～2，无关作用；FIC＞2，拮抗作用。

1.5 MPC的测定

1.5.1 含单药琼脂平板的配制 采用琼脂平板倍比稀释法测定抗菌药物分别对质控菌株和60株CRAB的MPC。LVX和CFS的药物浓度范围分别为0.125～512 mg/L和2～512 mg/L。每个浓度配制4个平板作为平行对照。

1.5.2 含两药琼脂平板的配制 以LVX和CFS的MIC、MPC为基准，采用二倍稀释法配制含两药混合的系列不同浓度梯度琼脂平板。以LVX和CFS的单药MIC为最低浓度，以LVX和CFS的单药MPC为最高浓度，每个浓度4个平板。

1.5.3 菌悬液制备 从新鲜过夜培养的细菌平板上挑取单个菌落接种于20 ml MH肉汤中37℃震荡过夜培养，3000 r/min离心后弃上清，再悬浮在200 ml MH肉汤中，震荡培养6 h，3000 r/min离心弃上清，调整菌液浓度为3×1013CFU/L。

1.5.4 MPC的测定 取100μl 3×1013CFU/L菌液均匀涂布于含不同浓度药物的MH平板上，每个浓度4个平板。（35±2）℃培养72 h，以4个平板均无细菌生长的最低药物浓度为MPC。对含单药琼脂平板的测定为单药MPC，对含两药琼脂平板的测定即为联合用药后的MPC。对接近MPC筛选出来的菌株接种于无药物的MH平皿，传代两次后，再接种于原筛选药物浓度的平板上，以确定其是耐药突变株。以上实验重复两次，取其平均值。计算选择指数（selectiveity index，SI），SI=MPC/MIC。

1.6 统计学分析数据分析采用SPSS 16.0统计软件对相关数据进行配对秩和检验；取P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 LVX与CFS的联用药敏结果对60株临床分离菌株，LVX与CFS联用后，协同作用所占的比例为 0.50（30/60），相加所占的比例为 0.43（26/60），无关作用所占的比例为0.07（4/60），未见拮抗作用，以协同和相加作用为主。

2.2 抗菌药物对鲍曼不动杆菌标准菌株ATCC19606的 MIC、MPC、SI值LVX、CFS单用或联用时对鲍曼不动杆菌标准菌株ATCC19606的MIC、MPC、SI值见表1。结果显示，LVX和CFS联合后，MIC分别由1.0 mg/L降为0.25 mg/L、2.0 mg/L降为0.5 mg/L；MPC分别由8.0 mg/L降为 1.0 mg/L、16.0 mg/L降为2.0 mg/L，MIC与MPC都有明显降低。LVX的MSW 由 1.0～8.0 降为 0.25～1.0；CFS 的 MSW 由2.0～16.0降为0.5～2.0，两者的MSW明显缩小。

表1 LVX和CFS单用及联用对标准菌株 ATCC19606的 MIC、MPC、SI值（mg/L）

2.3 LVX和CFS对60株临床分离菌株的MIC、MPC、SI值对60株临床分离菌株，LVX的MIC范围为 8～64 mg/L、MPC 范围为 64～256 mg/L；CFS 的MIC 范围为 8～32 mg/L、MPC 范围为 128～256 mg/L。联合用药后，LVX的MIC范围为 2～16 mg/L、MPC范围为 8～64 mg/L；CFS 的 MIC 范围为 4～16 mg/L、MPC范围为64～128 mg/L，MIC与MPC都有显著降低。联合用药后，LVX的MSW由8～128降为2～64；CFS的 MSW 由8～256降为 4～128，两者的 MSW 明显缩小；LVX、CFS单用对60株CRAB的SI分别为2～8、4～16；LVX、CFS 联合使用 后两 者对 60 株CRAB 的 SI分别为 2～32、4～16，与单独用药相比，SI值均有统计学意义（PLVX单用-联合=0.000；PCFS单用-联合=0.000）。结果显示LVX联合CFS显著降低了MPC，缩小MSW，可以有效地防止耐药突变菌株的产生。见表2。

表2 LVX和CFS单用及联用对60株临床分离菌株的MIC、MPC、SI值（mg/L）

3 讨论

随着抗生素在临床上的广泛应用，由耐碳青霉烯类鲍曼不动杆菌所引发的临床抗感染治疗失败及院内感染的流行，对人类健康造成严重威胁，已成为日益严重的公共卫生问题［8，9］。重症感染患者病死率相对较高，已成为临床治疗的一大难题。

该研究结果显示，LVX与CFS联合应用后，协同作用占50%，相加作用占43%，无关作用占7%，无拮抗作用，表明两药联合可增强抑菌效果。对鲍曼不动杆菌标准菌ATCC19606和60株临床分离菌株耐药性研究显示：LVX与CFS联用后，均可降低其单用对CRAB的MPC，缩小耐药突变选择窗，说明联合用药后可以有效地防止耐碳青霉烯类鲍曼不动杆菌耐药性的产生。

根据MIC理论用药，仅可阻止大部分敏感菌的生长，临床一般的治疗方案往往使药物浓度落入MSW内，引起耐药突变菌富集扩增。一旦富集扩增的耐药突变菌转移到新宿主身上，就会成为新的优势菌群，从而产生耐药，导致治疗失败。MPC是一个反映抗菌药物抗菌活性及药物抑制耐药突变株选择能力的药效学参数，与该药物限制该种细菌耐药突变株选择的能力成反比例关系。Nordqvist等［7］报道了多黏菌单用及联合利福平，可缩小其对耐碳青霉烯类鲍曼不动杆菌的MSW，防止多重耐药鲍曼不动杆菌耐药菌株出现。单药使用欲保持血药浓度大部分时间维持在高于MPC的水平，势必要增加给药剂量，同时也增加了药品不良反应。

MSW理论为临床合理用药、防止耐药菌产生提供了一种新思想，为指导临床合理使用抗生素、有效提高临床治愈率起到重要作用，也为控制耐药菌在院内传播、降低发病率和病死率发挥了积极的作用。该研究对LVX与CFS联用后治疗CRAB感染进行了初步探讨，由于体内药物浓度不断变化，影响因素较多，如何将体外研究结果应用于体内研究尚需进一步探讨。