酶制剂在柿子醋传统发酵生产中的应用研究

陈书明，张晶

(三门峡职业技术学院，三门峡市生物技术重点实验室， 河南 三门峡 472000)

柿子是我国重要的特色水果之一，其产量仅次于苹果、梨、葡萄，位居第四位。柿树在黄河流域的陕西、河南、河北及山西栽培最多[1]，占全国产量的70%～80%。据统计，我国每年的柿子产量排在世界首位，但是国际贸易金额不到全球贸易总额的3%[2]。我国柿子加工还停留在传统加工工艺阶段，柿饼和柿子醋是主要的加工产品。

随着生活水平的提高和人们对柿子中各种成分和药用价值的进一步了解，柿子醋逐步从调味品转变为人们眼中的保健品。目前，因生产成本和产品品质等原因，柿子醋生产主要依靠传统发酵工艺。河南省三门峡及周边地区的窑藏发酵工艺生产的柿子醋品质好，但发酵时间长、出汁率低、品质不均一，无法进行规模化生产。酶制剂作为生物制剂，在食品加工中广泛应用，但复合酶制剂在柿子醋生产中的应用鲜见报道。

本研究以柿子为原料，模拟窑藏柿子醋的发酵环境，通过添加多种酶制剂来改善传统发酵工艺生产柿子醋中存在的问题，为其规模化生产提供了一定的理论依据，以期获得发酵时间短、出汁率高、品质兼优的柿子醋。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

柿子：产自三门峡陕县；半纤维素酶、糖化酶、果胶酶、β-甘露聚糖酶：江苏锐阳生物科技有限公司；氢氧化钠：洛阳昊华化学试剂有限公司；邻苯二甲酸氢钾：天津市科密欧化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

HZQ-F160全温度振荡培养箱 太仓市华美生化仪器厂；PHS-3C数显酸度计 上海佑科仪器仪表有限公司；VAL-1N 酒精计 河北省武强县阜阳仪表厂；PAL-1型手持糖度计 ATAGO公司;UV-1100型紫外可见分光光度计 上海美谱达仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 工艺流程及操作要点

酶解

↓

柿子→挑选→清洗→脱涩→切分→发酵→过滤→装瓶→杀菌→成品。

脱涩：将成熟的新鲜柿子放置于38 ℃的恒温培养箱中24 h，完成脱涩。

切分：脱涩后用刀切成3～4 cm的小块。过小的柿子从中间纵切1次。

酶解：在切分后的柿子块中添加单一酶制剂或复合酶制剂，酶制剂的浓度为0.05 g/mL。

发酵：放置于26 ℃的恒温培养箱中，每天测定酸含量，当处理样品的70%～80%酸度值在3.0 mol/L以上时停止发酵。

过滤：双层尼龙窗纱过滤。

杀菌：在80 ℃煮15 min。

1.3.2 单因素试验设计

本研究进行柿子醋生产时是模拟三门峡当地的传统发酵方式，环境条件比较恒定，故对酶制剂的使用温度和pH值不进行优化，只考虑酶制剂的使用量对产品的影响。半纤维素酶(2×105U/g)、糖化酶(1×105U/g)、果胶酶(1×105U/g)、β-甘露聚糖酶(6×104U/g)的用量分别设定为1.0，2.0,2.0，3.0 g/kg，试验中将各种酶制剂配制成一定浓度的酶溶液，然后按梯度要求添加到切分后的柿子中，对照组内不加酶制剂。通过测定样品的吸光度值来检测酶处理效果，虽然酶产于整个发酵过程，考虑到发酵后柿子醋内菌体会影响到吸光度值，所以吸光度值在发酵前进行测定。测定吸光度时，每份样品添加两份水。

1.3.3 正交试验设计

按照1.3.1的工艺，在单因素试验结果的基础上各取 3 个水平进行 L9(34)正交设计试验，正交设计因素和水平见表1。

表1 正交设计因素和水平 Table 1 Factors and levels of orthogonal design g/kg

1.3.4 检测方法

对样品处理后，取样品中液体经4层纱布过滤后测定理化指标。固形物含量：采用糖度仪测定；pH值：采用pH计测定；酸度值：采用滴定法测定；吸光度值：采用紫外分光光度仪测定。

2 结果与分析

2.1 半纤维素酶添加量对柿子汁的影响

自然界中，半纤维素是第二大杂聚物，由杂聚多糖聚合而成，是植物体的主要成分之一。每种植物的半纤维素往往含有几种由两种或三种糖基构成的含有500～3000个糖单位的大分子多糖，植物组织中大量半纤维素以共价键连接到果胶或以氢键连接到纤维素上[3]。半纤维素很不稳定，在酸性环境下较纤维素易于水解成单体。

图1 半纤维素酶对柿子汁吸光度值的影响Fig.1 Effect of hemicellulase on absorbance value of persimmon juice

由图1可知，与对照相比，添加半纤维素酶后，在24 h内处理组柿子汁的吸光度值均低于对照组，但处理的前20 h，半纤维素酶添加量越大，吸光度值越大。这说明柿子汁的吸光度值是果汁的原有成分和半纤维素分解产物共同作用的结果，半纤维素酶添加量越大，底物的分解速度越快。添加量为1.0 g/kg时，吸光度值呈上升趋势，添加量为2.0，3.0 g/kg时呈先升高达到最大值后保持稳定的趋势，3种添加量在处理24 h时吸光度值几乎一样。说明添加这3种剂量的半纤维素酶，在24 h均能把样品内的半纤维素彻底分解。因为酶制剂存在于整个发酵过程中，考虑到成本因素和半纤维素酶对柿子醋品质的影响，半纤维素酶的最佳添加剂量确定为1.0 g/kg。

2.2 糖化酶添加量对柿子汁的影响

糖化酶能把淀粉从非还原性末端水介α-1,4葡萄糖苷键产生葡萄糖，也能缓慢水解α-1,6葡萄糖苷键，转化为葡萄糖。一直以来，因糖化酶能提高酒的出汁率，其被广泛用于各类酒的生产。

由图2可知，添加糖化酶后，处理组样品的吸光度值低于对照组；相同处理时间添加量越大，吸光度值降低越多；处理时间越长，吸光度值降低越多。在24 h内，各时间点测定的处理组间吸光度值差值几乎相同，如处理16 h添加1.0 g/kg比添加2.0 g/kg吸光度值大0.081，处理20 h为0.102，处理24 h为0.122。说明在测定的有限时间段内，底物的量远远大于酶制剂的量，这可能是因为在该处理温度下糖化酶活力过低导致的。因此，糖化酶的最佳添加量是3.0 g/kg。

图2 糖化酶对柿子汁吸光度值的影响Fig.2 Effect of glucoamylase on absorbance value of persimmon juice

2.3 果胶酶添加量对柿子汁的影响

柿子富含果胶物质，果胶物质包括原果胶、果胶和果胶酸，随着柿子的成熟，原果胶分解，成为可被人体利用的果胶和果胶酸[4]。在果汁加工中,果胶是造成出汁率低的主要因素之一[5]。酶催化反应可有效提高果汁的出汁率、澄清度[6，7],提高果汁的品质和产量。

图3 果胶酶对柿子汁吸光度值的影响Fig.3 Effect of pectinase on absorbance value of persimmon juice

由图3可知，添加果胶酶后，处理组的吸光度值远低于对照组。这说明果胶酶能有效降低果汁的粘稠度，研究中也发现，果胶酶处理的果汁相较于其他单一酶制剂透明度要好。添加1.0 g/kg果胶酶，随处理时间延长吸光度值呈先降低后稳定趋势，处理16 h时吸光度值与添加2.0 g/kg和3.0 g/kg一致；添加2.0 g/kg和3.0 g/kg的果胶酶处理1 h后，随着处理时间的延长，样品的吸光度值没有差异。这说明添加2.0 g/kg和3.0 g/kg的果胶酶能在1 h内分解完柿子样品中的果胶，添加1.0 g/kg时需要的时间长一点。果胶酶的处理效果好，除去酶制剂本身因素外，还可能是因为研究中采用的柿子本身成熟度比较高，又经过较高温度处理，样品内果胶含量减少引起的。因为果胶酶处理果汁后，并不对果胶酶灭活，其参与柿子的发酵过程，因此果胶酶的最佳添加量是1.0 g/kg。

2.4 β-甘露聚糖酶添加量对柿子汁的影响

甘露聚糖在植物组织里分布广泛，是一种线性多糖。其散状分布于木质素和纤维素之下，而且它将木质素与纤维丝条下不同位置上通过氢键共价结合形成包被。这个过程中氢键较少，所以比纤维素更容易受到破坏[8]。β-甘露聚糖酶是水解甘露聚糖的主要酶，攻击甘露聚糖主链内部的糖苷键，释放短的β-1,4-甘露低聚糖。添加β-甘露聚糖酶后，样品的吸光度值变化情况见图4。

图4 β-甘露聚糖酶对柿子汁吸光度值的影响Fig.4 Effect of β-mannanase on absorbance value of persimmon juice

由图4可知，所有处理组吸光度值均低于对照组，说明β-甘露聚糖酶在该处理温度、pH值等环境条件下具有活性。随时间延长，添加1.0 g/kg β-甘露聚糖酶吸光度值呈现先降低再升高后又降低的趋势，添加2.0 g/kg吸光度值呈现先升高后降低的趋势，添加3.0 g/kg吸光度值呈现先降低后保持相对稳定的趋势。说明添加3.0 g/kg β-甘露聚糖酶处理16 h后，样品内的甘露聚糖几乎被分解完全，而添加1.0，2.0 g/kg β-甘露聚糖酶在处理24 h时样品内的甘露聚糖还没有分解完，但是添加1.0 g/kg与添加2.0 g/kg差别不明显。考虑到酶处理后还有较长的发酵周期及成本问题，β-甘露聚糖酶的最佳添加量为1.0 g/kg。

2.5 复合酶制剂对柿子汁和柿子醋的影响

根据单因素试验结果，对半纤维素酶、糖化酶、果胶酶、β-甘露聚糖酶4种酶进行正交试验优化。酶有协同增效作用，正交试验时每种酶的最大添加量为单一使用的最佳添加量。考虑到采用单一酶制剂对样品进行处理时，糖化酶和β-甘露聚糖酶在处理24 h时没有将底物分解完，所以在正交试验时处理时间增加到28 h，温度不变。在此环境下，会有一定微生物的繁殖，影响吸光度值，为了增加试验结果的可信度，测定样品吸光度值的同时，还需测定样品的可溶性固形物含量，结果见表2。

表2 正交试验设计及综合评价结果 Table 2 Orthogonal experimental design and comprehensive evaluation results

由表2可知，对样品的吸光度值来说，这4种酶制剂的影响程度依次为：D>B>C>A；这4种酶制剂对可溶性固形物含量的影响程度也为D>B>C>A，β-甘露聚糖酶对样品的吸光度值和可溶性固形物含量影响最大，其次是糖化酶。酶制剂添加量越大，处理效果越好，单因素试验时发现，半纤维素酶和β-甘露聚糖酶添加量越大，吸光度值越大；糖化酶和果胶酶添加量越大，吸光度值越小，因此在选择复合酶制剂的最优方案时不能从9组处理方式中直接挑选出来。最优方案应该按照单一酶制剂对吸光度值的影响规律进行逐个挑选。半纤维素酶添加量越大，吸光度值越大，故其最佳浓度是k1对应的添加量0.6 g/kg，同理，β-甘露聚糖酶为0.6 g/kg；糖化酶添加量越大，吸光度值越小，因此其最佳添加量为k3对应的3.0 g/kg，同理，果胶酶为0.7 g/kg。

在本研究中，因为模拟传统发酵工艺的环境，但是又添加了酶制剂，发酵时间不能精确确定。根据试验设定，处理样品的正交试验共有9个处理组，当7组的酸度值在3.0 mol/L以上时停止发酵。本研究的发酵时间为25 d。发酵结束测定出醋率和醋的酸含量，结果见表2。影响出醋率和醋酸含量的4种酶制剂主次因素排序均是B>D>C>A，糖化酶对样品的出醋率和醋酸含量影响最大，其次是β-甘露聚糖酶。对照组出醋率为52%，酶制剂能提高柿子醋的出醋率。

由表2结果可知，糖化酶和β-甘露聚糖酶是影响柿子汁吸光度值和可溶性固形物含量及柿子醋的出醋率和酸含量的主要因素，半纤维素酶的影响最小。糖化酶因可以提高酒的出汁率和节省成本一直被广泛用于各类酒的生产，本研究结果显示，柿子醋的生产过程添加该酶制剂也能起到很好的效果。β-甘露聚糖酶应用于果汁或果醋的生产鲜有报道，但本研究中发现添加该酶制剂也能取得较好效果，这可能是因为柿子内半纤维的构成中甘露糖所占比例较大。半纤维素酶因是由木聚糖酶、葡聚糖酶、甘露聚糖酶等酶构成的复合酶，每种酶都有自己最合适的底物，如果其中一种或多种酶所需的底物不存在或者数量少，就会影响到复合酶的效果。正交试验中半纤维素酶的影响小可能就是该原因造成的。对照组的酸含量为1.27 mol/L，复合酶制剂处理组酸含量远大于对照组，说明酶处理能加速柿子醋的发酵。

3 结论

本研究以柿子为主要原料，研究半纤维素酶、糖化酶、果胶酶及β-甘露聚糖酶不同添加量对柿子汁品质和柿子醋出醋率及酸含量的影响，采用单因素试验以及正交优化试验， 探究单一酶制剂和复合酶制剂的最佳使用量。酶制剂单一使用时，最佳组合为半纤维素酶1.0 g/kg、糖化酶3.0 g/kg、果胶酶1.0 g/kg、β-甘露聚糖酶1.0 g/kg；复合使用时，最佳组合为半纤维素酶0.6 g/kg、糖化酶3.0 g/kg、果胶酶0.7 g/kg、β-甘露聚糖酶0.6 g/kg。复合酶制剂添加到柿子醋的传统发酵工艺中，能提高柿子的出醋率；能把生产周期由原来的3～10个月缩短为25 d；柿子醋颜色为淡黄色，比传统的褐色保留了较多的营养成分，但是柿子醋的柿子固有香气弱，酸味不柔和。