猪伪狂犬病进口与国产gE基因缺失活疫苗免疫效果的比较

孟帆 赵岳 樊振华 吴忻 薛翼鹏 米瑞娟 姚敬明

摘要 [目的]了解猪伪狂犬病gE基因缺失活疫苗的免疫效果，同时制定合理的免疫程序。[方法]选用国产和进口2种猪伪狂犬病gE基因缺失活疫苗，采用2种不同的免疫程序进行了免疫对比试验。[结果]无论是用国产的还是进口的猪伪狂犬病gE基因缺失活疫苗免疫，试验猪10、20、30、40、50、60、70日龄猪伪狂犬病病毒gB抗体S/N平均值各组间差异均不显著（P>0.05）;80日龄，实行3次免疫的试验猪伪狂犬病病毒gB抗体S/N平均值显著高于2次免疫的试验猪（P<0.05）;90、100、115日龄，实行3次免疫的试验猪伪狂犬病病毒gB抗体S/N平均值极显著高于2次免疫的试验猪（P<0.01）。整个试验期，通过对国产和进口猪伪狂犬病gE基因缺失活疫苗免疫效果的对比，发现试验猪伪狂犬病病毒gB抗体S/N平均值各组间差异均不显著（P>0.05）。[结论]该免疫试验结果可为猪伪狂犬病免疫防控程序的应用提供依据。

关键词 猪伪狂犬病;gE基因缺失活疫苗;免疫试验

中图分类号 S859文献标识码 A

文章编号 0517-6611（2019）14-0091-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.14.028

开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Abstract [Objective] To understand the immune effect of gEgenedeleted attenuated vaccine of pseudorabies virus and establish reasonable immune procedure.  [Method] Domestic and imported gEgenedeleted attenuated vaccine of pseudorabies virus were selected and 2 different immune procedures were used to conduct the immune contrast test. [Result] There was no significant difference（P>0.05）of the average S/N mean value of gB antibody against porcine pseudorabies virus between domestic and imported gEgenedeleted attenuated vaccine of pseudorabies virus at 10，20，30， 40，50， 60，70 dayages.  And the average S/N value of gB antibody against porcine pseudorabies virus in the third immunization group was significantly higher than that in the second immunization group （P<0.05） at 80dayage. At 90，100，115 dayages， the average S/N value of gB antibody against porcine pseudorabies virus in the third immunization group was significantly higher than that in the second immunization group（P<0.01）. During the whole trial period，  there was no significant difference in the average S/N value of gB antibody against porcine pseudorabies virus between domestic and imported gEgenedeleted attenuated vaccine of pseudorabies virus among all groups （P>0.05）. [Conclusion]The research results could provide the basis for the application of the immune prevention and control program of pseudorabies in pigs.

Key words Pseudorabies;gEgenedeleted attenuated vaccine;Immunity test

作者簡介 孟帆（1980—），女，山西太原人，副研究员，硕士，从事动物疫病分子生物学检测与诊断技术研究。*通信作者，研究实习员，硕士，从事动物疫病分子生物学检测与诊断技术研究。

收稿日期 2018-12-10

猪伪狂犬病（pseudorabies，PR）是一种由猪伪狂犬病病毒（pseudorabies virus，PRV）感染导致的一种以发热、奇痒及脑脊髓炎为主的高度接触性、急性传染病[1-3]。该病的主要宿主和传染源是猪[4]， 可通过消化道和呼吸道传播，也可通过交配、精液、胎盘垂直传播。

该病自1902年匈牙利首次被发现以来广泛分布于世界各地，已有50多个国家和地区报道该病的流行。我国自1948年首次报道该病后，迄今已有多个省份相继报道了该病， 并在许多种猪场呈暴发流行趋势，给我国养猪业特别是集约化养猪造成了巨大的经济损失[5]。近年来种猪场对该病的免疫防控非常重视，但在临床上母猪流产、死胎、木乃伊以及仔猪神经症状等现象时有发生。笔者从不同地市的11个规模型种猪场采集血样，用猪伪狂犬病gE抗体检测试剂盒进行检测，发现母猪猪伪狂犬病野毒感染率为57.94%，仔猪感染率为34.66%，达到净化该病的目标任务还很艰巨。笔者选用国产和进口猪伪狂犬病gE基因缺失活疫苗，对仔猪进行2次或3次免疫试验，旨在为选择疫苗、探索有效的免疫程序提供科学依据，为有效控制该病的流行提供一种技术支持。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 试剂盒。猪伪狂犬病病毒gB 和gE 蛋白ELISA抗体检测试剂盒购自武汉科前生物股份有限公司。

1.1.2 试验猪群。近几年来对20个示范猪场检测猪瘟病毒、猪伪狂犬病病毒、猪圆环病毒免疫抗体和感染抗体的基础上，选择大同阳高×种猪场（gE抗体检测为阴性），2015年9月在免疫试验前对该猪场母猪每次免疫后进行跟踪检测猪伪狂犬病病毒gB 和gE抗体，2016年9月对该猪场不同日龄仔猪进行了抽查检测，再次确定该猪场母猪、仔猪猪伪狂犬病病毒gE抗体检测全部为阴性时，选择该场60头母猪，300头仔猪为试验猪群。

1.1.3 试验疫苗。进口、国产猪伪狂犬病gE基因缺失活疫苗分别购自美国某公司和上海某生物技术股份有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 试验动物分组与免疫。在试验场根据母猪怀孕产子情况，选择60头母猪、300头仔猪，随机分成4组，每组选择40头左右仔猪进行免疫试验。

试验 Ⅰ 组：用美国某公司生产的猪伪狂犬病gE基因缺失活疫苗，公猪母猪每年2、5、8、11月进行4次普防，剂量2头份/头;仔猪1日龄滴鼻，35日龄注射，剂量1头份/头。试验Ⅱ组：用美国某公司生产的猪伪狂犬病gE基因缺失活疫苗，公猪母猪每年2、5、8、11月进行4次普防，剂量2头份/头;仔猪1日龄滴鼻，35日龄、65日龄注射，剂量1头份/头。试验Ⅲ组：用上海某生物技术股份有限公司生产的猪伪狂犬病gE基因缺失活疫苗，公猪母猪每年2、5、8、11月进行4次普防，剂量2头份/头;仔猪1日龄滴鼻，35日龄注射，剂量1头份/头。试验Ⅳ组：用上海某生物技术股份有限公司生产的猪伪狂犬病gE基因缺失活疫苗，公猪母猪每年2、5、8、11月进行4次普防，剂量2头份/头;仔猪1日龄滴鼻，35日龄、65日龄注射，剂量1头份/头。

1.2.2 采血时间及方式。对母猪每次免疫后20 d从颈静脉或耳静脉随机采集血样20头，每头采血3～5 mL，检测1次gB 和gE抗体。对免疫试验仔猪，每10 d定时随机从试验猪前腔静脉采集血样10份左右，每份采血3～5 mL，并及时分离血清，-20 ℃下冷冻保存，备用。

1.2.3 抗体检测和判定方法。采用阻断 ELISA 法进行抗体检测，具体步骤严格按照ELISA检测试剂盒使用说明书进行操作）。

1.2.3.1 抗体检测方法。首先配制洗涤液，稀释样品及阴性、阳性对照，取抗原包被板设置阴性和阳性对照，加样后37 ℃孵育，再弃去孔中液体，用洗涤液洗板;然后，加酶标记物37 ℃孵育，用洗涤液洗板。接着，再加入底物液A、B 混合于室温（20～25 ℃）避光显色，最后加入终止液混匀后在10 min内于 630 nm 处测定各孔的OD 值。

1.2.3.2 结果判定。

（1）猪伪狂犬病病毒gB蛋白ELISA抗体检测。在酶标仪上测定各孔OD630 nm值。试验成立的条件如下：阴性对照孔平均OD630 nm值-阳性对照孔平均OD630 nm值≥0.4。S=样品孔OD630 nm值，N=阴性对照孔平均OD630 nm值，若S/N值≤0.6，样品判定为抗体阳性;若S/N>0.7，样品判定为抗体阴性;若0.6

（2）猪伪狂犬病病毒gE蛋白ELISA抗体检测。在酶标仪上测定各孔OD630 nm值。试验成立的条件如下：阴性对照孔平均OD630 nm值-阳性对照孔平均OD630 nm 值≥0.3。S=样品孔OD630 nm值，N=阴性对照孔平均OD630 nm值。若S/N值≤0.35，样品判定为抗体阳性;若S/N>0.4，样品判定为为抗体阴性;若0.35

2 结果与分析

2.1 试验前母猪体内猪伪狂犬病病毒gB和gE抗体检测结果 在母猪每个季度进行普免后20 d，采集血样进行猪伪狂犬病病毒gB和gE抗体检测。由表1可知，猪伪狂犬病病毒gB抗体全部为阳性，gE抗体全部为阴性。

2.2 免疫试验前仔猪体内猪伪狂犬病病毒gB和gE抗体检测结果 2016年9月在开展免疫试验前，对猪场10～60日龄仔猪进行猪伪狂犬病病毒gB抗体和gE抗体抽检，结果发现gB抗体全部为阳性，gE抗体全部为阴性（表2）。

2.3 试验期间仔猪体内猪伪狂犬病病毒gB抗体检测结果 对分组免疫试验仔猪，在免疫后每隔10 d进行采血，检测猪伪狂犬病gB抗体。由表3可知，在整个试验期，无论是用上海某生物技术股份有限公司生产的猪伪狂犬病gE基因缺失活疫苗免疫2次的试验 Ⅰ 组与免疫3次的试验 Ⅱ 组相比，还是用美国某公司生产的猪伪狂犬病gE基因缺失活疫苗免疫2次的试验Ⅲ组与免疫3次的试验Ⅳ组相比，试验猪10、20、30、40、50、60、70日龄猪伪狂犬病病毒gB抗体S/N平均值各组间差异均不显著（P>0.05）。试验猪80日龄，试验Ⅰ组与试验Ⅱ组相比，猪伪狂犬病病毒gB抗体S/N平均值差异显著（P<0.05）;试验Ⅲ组与试验Ⅳ组相比，猪伪狂犬病病毒gB抗体S/N平均值差异显著（P<0.05）。试验猪90、100、115日龄时，试验Ⅰ组与试验Ⅱ组相比，猪伪狂犬病病毒gB抗体S/N平均值差异极显著（P<0.01）;试验Ⅲ组与试验Ⅳ组相比，猪伪狂犬病病毒gB抗体S/N平均值差异极显著（P<0.01）。无论是用上海某生物技术股份有限公司生产的猪伪狂犬病gE基因缺失活疫苗还是用美国某公司生产的猪伪狂犬病gE基因缺失活疫苗进行3次免疫的试验Ⅱ组和试验Ⅳ组抗体可以维持较长时间。

由表3还可知，整个试验期，试验 Ⅰ 组与试验Ⅲ组相比，猪伪狂犬病病毒gB抗体S/N平均值差异均不显著（P>0.05），试验Ⅱ组与试验Ⅳ组相比，猪伪狂犬病病毒gB抗体S/N平均值差异也不显著（P>0.05）。

3 讨论

猪伪狂犬病对世界各国养殖业的危害是极大的，目前防控和根除猪伪狂犬病的主要措施还是免疫接种疫苗，不同规模生猪养殖场中主要应用猪伪狂犬病疫苗进行免疫[6]。自2011年以来，猪伪狂犬病在国内猪场大范围暴发，从华北、华中到华东、华南均有发生[7]，阴性猪场纷纷转阳，给我国生猪养殖业带来巨大的经济损失。在猪伪狂犬病猖狂暴发的大环境下，除了需要选择有保护力的疫苗外，制定合适的免疫程序也是猪只自身增强对病毒感染的抵抗力、防止病毒激活、减少病毒传播率的关键所在。为了加强对猪伪狂犬病的防控力度，当前大部分猪场普遍采用的是公猪、母猪4次普防，仔猪3次免疫的免疫程序。雷宇平等[8]曾报道2015年山西省母猪群野毒感染率达49.06%，处于相对较高水平，可见山西省猪伪狂犬病野毒感染普遍存在且比较严重，这对山西省生猪养殖行业的影响是不容低估的。笔者选用国产和进口猪伪狂犬病gE基因缺失活疫苗，在猪伪狂犬病阴性猪场对仔猪进行2次或3次免疫，对比其免疫效果，以期为山西猪伪狂犬病的防控提供一种技术支持。

目前我国大部分生猪养殖场防控猪伪狂犬病主要使用gE 基因缺失活疫苗，因为使用这种疫苗可以通过血清学方法区分自然感染猪和免疫猪[9]。该试验选用国产和进口猪伪狂犬病gE基因缺失活疫苗，公猪、母猪4次普防，在猪伪狂犬病阴性猪场对仔猪进行2次或3次免疫，结果表明无论是用国产的还是进口的猪伪狂犬病gE基因缺失活疫苗进行免疫，试验猪前70日龄猪伪狂犬病病毒gB抗体S/N平均值各组间差异均不显著（P>0.05）;80日龄，实行3次免疫的试验猪伪狂犬病病毒gB抗体S/N平均值显著高于实行2次免疫的试验猪（P<0.05）;90、100、115日龄，实行3次免疫的试验猪伪狂犬病病毒gB抗体S/N平均值极显著高于实行2次免疫的试验猪（P<0.01）。由此可见，公猪、母猪实行4次普防，仔猪3次免疫的免疫程序最佳。这与张敏等[10]研究的仔猪实行3次免疫的免疫程序在猪伪狂犬病阴性猪场能取得较好的免疫效果相一致。戴爱玲等[11]也认为在临床上加强疫苗免疫可以降低发病猪临床症状的发生。

整个试验期，国产和进口的猪伪狂犬病gE基因缺失活疫苗免疫试验对比发现，进口的猪伪狂犬病gE基因缺失活疫苗免疫后试验猪伪狂犬病病毒gB抗体S/N平均值高于国产的猪伪狂犬病gE基因缺失活疫苗免疫后试验猪的伪狂犬病病毒gB抗体S/N平均值，但差异均不显著（P>0.05），可见不论是进口的还是国产的猪伪狂犬病gE基因缺失活疫苗给猪免疫都可以产生良好的免疫效果，这与姚敬明等[12]的研究结果相一致，这些疫苗都可以推广应用。

猪伪狂犬病作为危害目前规模化猪场的主要传染病之一，能引起种猪的繁殖障碍、仔猪的神经症状及高死亡率以及生长育肥猪的呼吸道病综合征。尽管目前我国的免疫防控水平非常高，技术也十分成熟，但该病并没有被彻底消灭，给养猪场带来的经济损失仍然非常严重。根据我国《国家中长期动物疫病防治规划（2012—2020 年）》考核标准，2020 年全国所有种猪场达到猪伪狂犬病净化標准。血清学调查是制订净化策略的基础，因此加强免疫防控，定期进行猪伪狂犬病病毒gB/gE抗体检测，制定适合本场猪群的最佳免疫程序和净化方案是防控猪伪狂犬病的根本措施。此外，还需要科技人员、猪场技术人员和管理人员共同不懈努力，争取早日实现这一目标。

参考文献

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[11] 戴爱玲，范克伟，李晓华，等. 闽西南地区部分规模化猪场猪伪狂犬野毒感染的血清流行病学调查[J].安徽农业大学学报， 2016，43（1）：51-55.

[12] 姚敬明，王娟萍，韩一超，等. 猪伪狂犬病病毒gE基因缺失苗免疫试验[J].中国畜牧兽医，2011，38（2）：184-186.