沙糖桔葡萄复合果酒酿造工艺研究

陈 静，南立军*，温金英，李雪梅，王合意

（1.北部湾大学 食品工程学院，广西 钦州 535000；2.楚雄师范学院 化学与生命科学学院，云南 楚雄 675000；3.楚雄师范学院 云南省高校葡萄与葡萄酒工程技术研究中心，云南 楚雄 675000）

沙糖桔是柑桔类的名优品种，富含维生素C（vitaminC，VC）及人类必需的各类营养元素，具有一定的保健功能[1-3]。广西具有适合沙糖桔种植的独特地理及气候环境，自20世纪80年代引入沙糖桔以来，其种植面积逐年增加[4]。为了提升沙糖桔的附加值，众多的研究学者对其精深加工产品作了大量的研究工作，主要集中在利用沙糖桔制作果酒，但其效果不是很理想[5]。主要原因在于柑橘酒苦味难以消除，营养功能单一以及香气滋味结构欠佳等，所以柑橘类果酒市场未能打开。鉴于此，众多的研究学者对苹果、雪梨、猕猴桃、黄金梨与柑橘混合发酵[6-9]进行研究，以解决上述问题，取得了一定的成果，然而未能进行推广应用。但这为沙糖桔与其他果品混合发酵制作果酒开辟了一条新的道路。

葡萄是世界最古老的果树树种之一[10]，葡萄主要以葡萄糖为主，含多种人体所需的氨基酸，药用价值极高[11]。常见的葡萄加工产品有葡萄干、葡萄汁、葡萄酒、葡萄籽饮料、葡萄籽油等[12]。其中葡萄酒最为研究学者热爱，主要研究内容有酿造工艺、澄清效果、酵母纯化筛选、葡萄酒成分分析[13]。何凤梅等[14-15]对黑枸杞、蓝毒、玫瑰茄、苹果、山楂等水果与葡萄进行了复合酿造工艺研究，在风味以及口感上均取得一定成果。

本研究将以葡萄与沙糖桔进行混合发酵制备复合果酒，通过单因素试验和正交试验，探索沙糖桔葡萄复合果酒的发酵工艺、脱苦工艺以及澄清工艺，通过复合果酒的理化指标和感官评价作为参考，确定沙糖桔葡萄复合果酒的最优工艺条件，以期得到口感、品质、香气平衡、滋味协调的沙糖桔葡萄复合果酒，解决沙糖桔销售难和烂果的状况、提高水果的附加值、丰富市场品种，为复合果酒的发展研究提供基础数据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 原材料

沙糖桔、巨峰葡萄、白砂糖：市售。

1.1.2 化学试剂

焦亚硫酸钾（SO2含量＞56%）、果胶酶（5×105U/g）：烟台帝伯仕自酿剂有限公司；柚苷酶（1 100万U/g）：江苏采薇生物科技有限公司；福林酚（分析纯）：上海麦克林生化科技有限公司；葡萄糖、酒石酸钾钠、氢氧化钠、硫酸铜（均为分析纯）：天津市致运化学试剂有限公司；甲醇、叔戊醇、异丁醇、异戊醇标准品（纯度≥99.5%）：山东西亚化学工业有限公司；聚乙烯聚吡咯烷酮（polyvinylpolypyrrolidone，PVPP）（纯度≥99.5%）：北京方程生物科技有限公司；帝伯仕18度酵母：烟台良缘酒业有限公司。

1.2 仪器与设备

UV-1800紫外可见分光光度计：岛津仪器（苏州）有限公司；WYT-J手持糖量计：上海仪迈仪器科技有限公司；果立方Q8榨汁机：佛山市润物电器有限公司；Agilent7890B气相色谱仪：安捷伦科技（中国）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 沙糖桔葡萄复合果酒的加工工艺流程[16-18]

沙糖桔汁的制备：沙糖桔→预处理（剥皮、除去橘络）→榨汁→酶解、灭酶→过滤→沙糖桔汁

巨峰葡萄汁的制备：巨峰葡萄→清洗→晾干→除梗→挤碎→葡萄汁

沙糖桔汁、葡萄汁→成分调整→接种酵母→主发酵→后发酵→脱苦澄清→灌装→果酒

1.3.2 操作要点[19-20]

沙糖桔汁、巨峰葡萄汁的制备：选择成熟的沙糖桔和葡萄，沙糖桔剥皮，并把桔子辨上的橘络去除干净。葡萄先清洗，晾干，除梗，挤碎。沙糖桔和葡萄分别用榨汁机直接榨取葡萄汁和沙糖桔汁。

酶解处理：沙糖桔汁和葡萄汁按一定比例混合，加入果胶酶，溶解果胶。加入300mg/L硫酸铵为酵母提供铵盐，加100～200mg/L焦亚硫酸钾以达到杀菌作用，提高稳定性，使酒醇香更浓郁[21]。调节果胶酶最适温度50℃，果胶酶最适pH至3.5左右酶解2 h，果胶被酶解完全[22]，采用虹吸法得到上层澄清的果汁。

成分调整：沙糖桔和葡萄含糖较高，为使成品酒达到适当的酒精度，根据水果原料的含糖量，通过添加白糖来调整发酵前果汁的总糖含量，调整初始糖度22°Bx。

主发酵：取0.1～0.5 g/kg的酵母加入5%的糖水中置于35℃的水浴锅中保持30m in将酵母活化，于沙糖桔和葡萄混合汁中加入活化好的酵母0.2 g/kg，搅拌均匀，调节发酵罐内温度至26℃，每天进行搅拌2～3次，第5天皮渣分离用四层滤布进行分离，主发酵期间，检测发酵液的酒精度、总酸和还原糖等含量的变化，待发酵液的残糖量降至4g/L时，主发酵结束[23]。

后发酵：主发酵结束，将分离压榨去除果渣的发酵液转入后发酵容器中，同时补加30～50mg/L的SO2，于16℃恒温培养箱中进行后发酵，直至还原糖不再变化时发酵结束[23]。

脱苦澄清：在后发酵结束后，对原酒进行脱苦处理，称取一定量的柚苷酶放进原酒中摇匀，王鸿飞等[24]优化柚皮苷酶的工艺研究中指出，柚皮苷酶用量为0.5 g/L，果汁温度为60℃，果汁pH值为4，作用时间为90m in，用柚皮苷酶对柑橘类果汁进行脱苦具有良好的效果且脱苦率达90.55%。在经脱苦后的复合果酒中添加加入为0.04%果胶酶的澄清剂，室温内静置48 h左右，待酒液澄清后，取上层澄清液在紫外分光光度计上于波长680 nm处测透光率。通过硅藻土滤网过滤，除去悬浮颗粒及胶体杂质，获得复合果酒成品酒。

1.3.3 复合果酒发酵工艺优化

（1）发酵工艺优化单因素试验

采用单一变量控制法进行单因素试验，以葡萄汁添加量分别为30%、40%、50%、60%、70%；帝伯仕18度酵母添加量分别为0.1 g/kg、0.2 g/kg、0.3 g/kg、0.4 g/kg、0.5 g/kg；初始糖度分别为18 °Bx、20 °Bx、22 °Bx、24 °Bx、26°Bx。考察葡萄汁添加量、酵母添加量、初始糖度对沙糖桔葡萄复合果酒的感官品质和理化指标的影响。

（2）发酵工艺优化正交试验

在单因素试验的基础上，采用L9（34）正交设计，以葡萄汁添加量（A）、酵母添加量（B）、初始糖度（C）为自变量，以感官评分及理化指标为考察指标，通过3因素3水平正交试验，确定复合果酒发酵工艺条件，正交试验因素与水平见表1。

表1 复合果酒发酵工艺优化正交试验因素与水平Table 1 Factors and levels of orthogonalexperiments for fermentation technology optim ization of compound wine

1.3.4 复合果酒脱苦工艺优化

（1）脱苦工艺优化单因素试验

于复合果酒中分别添加柚苷酶0.02%、0.03%、0.04%、0.05%、0.06%，分别置于45℃、50℃、55℃、60℃、65℃温度条件，分别保持45min、60m in、75m in、90m in、105m in，考察柚苷酶添加量、温度、时间等对复合果酒感官评价的影响。

（2）脱苦工艺优化正交试验

在单因素试验的基础上，采用L9（34）正交设计，以柚苷酶添加量（A）、酶解温度（B）、酶解时间（C）为自变量，以感官评分为评价指标，通过3因素3水平正交试验确定复合果酒的脱苦工艺，正交试验因素与水平见表2。

表2 复合果酒脱苦工艺优化正交试验因素与水平Table 2 Factors and levels of orthogonalexperiments for debittering technology optim ization of com pound wine

1.3.5 复合果酒的澄清

在单一的澄清剂对沙糖桔葡萄复合果酒澄清效果的影响的结果下，对复合澄清剂进行复合果酒澄清效果的考察，其组合如表3所示。

表3 复合果酒复合澄清剂组合Table 3 Composition of com pound clarifying agent of com pound fruitwine

1.3.6 砂糖桔葡萄复合果酒的品质分析

（1）感官评价

感官评定小组由10名专业的感官评价员组成，评价满分为100分，参照国标GB 15037—2006《葡萄酒》[25]、农业标准NY/T 1508—2017《绿色食品果酒》[26]，建立沙糖桔葡萄复合果酒的感官评价标准，结果见表4。

表4 复合果酒感官评分标准Table 4 Sensory evaluation standards for compound fruitwine

续表

（2）复合果酒脱苦工艺的感官品评

参照标准和文献[26-28]的基础上，制定了沙糖桔和葡萄复合果酒脱苦工艺的感官评定标准，满分10分，结果见表5。

表5 复合果酒苦味感官评分标准Table 5 Sensory evaluation standards for bitterness of compound fruitwine

（3）理化指标的检测

依据相关标准[29-31]，测定复合果酒的总酸、酒精度、总糖、甲醇、杂醇油、单宁指标。

2 结果与分析

2.1 发酵工艺优化单因素试验

2.1.1 葡萄汁添加量对复合果酒的影响

分别取30%、40%、50%、60%、70%的葡萄汁加入沙糖桔汁中发酵，考察其对复合果酒的影响，结果见表6。

表6 葡萄汁添加量对复合果酒品质的影响Table 6 Effect of grape juice addition on the quality of compound fruitwine

由表6可知，随葡萄汁添加量30%～70%范围内增加，对复合果酒酒精度的影响和残糖量的变化不大，感官评分随葡萄汁的添加先升高后下降，在葡萄汁添加量为50%时到达峰值，为78.4分。葡萄汁添加量越少，果酒苦、呛喉、后苦越重，酒体颜色偏黄；总酸随葡萄汁添加量的增加而增加，因此酸涩味越重；酒体颜色随葡萄汁添加量的增加而越偏红色。单宁的含量随葡萄汁添加量的增多而上升，主要是因为单宁存在于葡萄的表皮中[32]。甲醇和杂醇油随葡萄添加量增大，甲醇主要是由果胶在甲酯酶的作用下水解和甘氨酸转换而成。因此，综合分析可得最佳葡萄汁添加量为50%。

2.1.2 酵母添加量的确定

酿酒酵母添加量分别为0.1g/kg、0.2g/kg、0.3g/kg、0.4g/kg、0.5 g/kg，考察酵母添加量对沙糖桔葡萄复合果酒品质的影响，结果见表7。

表7 酵母添加量对复合果酒品质的影响Table 7 Effect of yeast addition on the quality of compound fruitwine

由表7可知，复合果酒的酒精度跟随着酵母量0.1～0.5 g/kg范围内，对复合果酒酒精度的影响和残糖量的变化不大，当酵母添加量为0.2 g/kg复合果酒的感官得分也达到峰值，为69.8分。酵母量超过0.5 g/kg时，发酵液中糖分主要用在酵母的繁殖上，生成的酒精度低，营养成分消耗过快和代谢物的产生，使酵母生长环境质量下降导致过早衰老并产生自溶现象，复合果酒中残留的酵母味越重。因此，综合分析可得最佳酵母添加量为0.2 g/kg。

2.1.3 最佳初始糖度的确定

初始糖度分别为18 °Bx、20 °Bx、22 °Bx、24 °Bx、26 °Bx，考察初始糖度对沙糖桔葡萄复合果酒品质的影响，结果见表8。

表8 初始糖度对复合果酒品质的影响Table 8 Effectof initialsugar contenton the quality ofcompound fruitwine

由表8可知，总酸随初始糖度18～26°Bx的增加变化不大，酒精度和感官得分随着初始糖度的增加呈上升后下降的趋势，在糖度为24°Bx时达到峰值，感官评分为71.5分，残糖量为1.225 g/L，单宁含量高为473.420mg/L，甲醇含量为189.87mg/L。初始糖度＞24°Bx时，则出现下降趋势，残糖高含量升高为1.825 g/L，酵母渗透压也增大，出现停滞期延长，果酒品质下降。因此，综合分析可得最佳初始糖度为24 °Bx。

2.2 发酵工艺优化正交试验结果和分析

在单因素试验的基础上，以感官评分作为考察指标，确定最佳发酵工艺条件，正交试验结果与分析见表9，方差分析见表10。

表9 复合果酒发酵工艺优化正交试验结果与分析Table 9 Results and analysis of orthogonalexperiments for fermentation technology optim ization of compound fruitwine

由表9可知，对于考察指标感官评分来说，A＞B＞C，即葡萄添加量＞酵母添加量＞初始糖度，因此最佳组合为A3B1C1，即葡萄汁添加量为60%，酵母添加量为0.1 g/kg，初始糖度为20°Bx。对于考察指标酒精度来说，C＞A＞B，即初始糖度＞葡萄汁添加量＞酵母添加量，因此最佳组合为A2B2C3，即初始糖度为24°Bx，葡萄汁添加量为50%，酵母添加量为0.2 g/kg。综合分析，最佳发酵工艺组合为A3B1C3，即葡萄汁添加量为60%，酵母添加量为0.1g/kg，初始糖度为24°Bx。在此条件下重复3次平行验证试验，可获得感官评分为82.8分，酒精度为11.88%vol的复合果酒。由表10可知，葡萄添加量对感官评分影响显著（P＜0.05），其他因素对感官评分影响不显著（P＞0.05）。

表10 复合果酒发酵工艺优化正交试验结果方差分析Table 10 Variance analysis of orthogonalexperiments results for fermentation technology optim ization of compound fruitwine

2.3 脱苦工艺优化单因素试验

2.3.1 柚苷酶添加量

图1 柚苷酶添加量对复合果酒脱苦效果的影响Fig.1 Effect of naringinase addition on debittering effect of compound fruitwine

由图1可知，感官评分随着柚苷酶添加量在0.02%～0.06%范围内先增大后缓慢减小，添加量为0.05%时达到最大值为6.9分。当柚苷酶用量少时，苦味物质水解不完全，复合果酒中苦味重，用量过多时，苦味物质虽然完全水解，但是过多的酶蛋白会引起不良反应，从而使复合果酒的品质受到影响。因此，最适柚苷酶添加量为0.03%～0.05%。

2.3.2 酶解温度

图2 柚苷酶酶解温度对复合果酒脱苦效果的影响Fig.2 Effectof enzymatic hydrolysis temperature on debittering effect of compound fruitwine

由图2可知，苦味感官评分随着柚苷酶的酶解温度45～65℃范围内而出现先升后降的趋势，在酶解温度60℃时达到最大值7.0分。温度太低时，激发不了酶的活力，无法发挥酶的作用，导致脱苦效果不明显；温度太高时，使酶蛋白变性失活，从而降低脱苦效果。因此，最适酶解温度为60℃。

2.3.3 酶解时间

由图3可知，苦味感官评分随着酶解时间在45～105min的范围内出现先升高后下降的趋势，酶解时间为75min时脱苦效果好，苦味感官评分最高为6.5分。酶解时间太短时，复合果酒中苦味物质水解程度不足，脱苦效果不明显；酶解时间过长，苦味物质水解完全，但是会影响复合果酒的其他营养成分，导致品质下降，影响口感。因此，最适酶解时间为75m in。

图3 柚苷酶酶解时间对复合果酒脱苦效果的影响Fig.3 Effect of naringinase enzymatic hydrolysis time on debittering effectof compound fruitwine

2.4 复合果酒的脱苦工艺优化正交试验

在单因素试验的基础上，以苦味感官评分为评价指标进行脱苦工艺优化正交试验，正交试验结果与分析见表11，方差分析见表12。

表11 复合果酒脱苦工艺优化正交试验结果与分析Table 11 Results and analysis of orthogonalexperiments for debittering technology optim ization of compound fruitwine

表12 复合果酒脱苦工艺优化正交试验结果方差分析Table 12 Variance analysis of orthogonalexperiments results for debittering technology optim ization of compound fruitwine

由表11可知，各个因素对复合果酒脱苦对效果有影响顺序为C＞B＞A，即酶解时间＞酶解温度＞酶添加量。沙糖桔葡萄复合果酒脱苦工艺的最佳组合为A1B3C3，即酶解时间90min，酶解时解温度90℃，酶的添加量0.03%。在此最佳脱苦工艺条件下，苦味感官评分为7.5分。

由表12可知，因素C对复合果酒脱苦效果的苦味感官评分有显著影响（P＜0.05），因素A、B无显著影响（P＞0.05）。

2.5 复合澄清剂对复合果酒的影响

果胶酶的添加量为0.04%时，透光率随PVPP的增加而降低，果胶酶的添加量量为0.06%时，透光率随PVPP的增加先下降后增大，果胶酶的添加量为0.08%时，PVPP添加量对透光率变化影响不大。总体上来说复合澄清剂的澄清效果更好，且果香和酒香比单一澄清剂更协调。综合分析，果胶酶添加量为0.06%和PVPP添加量为0.02%的组合澄清效果更佳。

表13 复合澄清剂对复合果酒澄清效果的影响Table 13 Effect of compound clarifying agent on the clarification effect of compound fruitw ine

2.6 沙糖桔葡萄复合果酒的质量分析

沙糖桔葡萄复合果酒的酒香更协调，酒体呈红色，清澈透亮且色泽，酸涩适中。总酸为6.458g/L，总糖为1.975 g/L，单宁含量为498.495mg/L，甲醇含量为229.99mg/L，杂醇油含量为211.836mg/L，理化指标均符合果酒的标准。

3 结论

实验研究以沙糖桔和葡萄作为原料发酵的复合果酒酿造工艺，利用单因素和正交实验结合的方法对发酵果酒和果酒脱苦工艺的进一步优化，最终得到沙糖桔葡萄复合果酒的最佳发酵工艺和最佳脱苦工艺。结果表明，最优发酵工艺条件为葡萄添加量60%，酵母添加量0.1 g/kg，初始糖度24°Bx，发酵温度为24℃，主发酵时间为8 d。最优脱苦工艺条件为：柚苷酶添加量0.03%，酶解温度为50℃，酶解时间为90min；在主发酵前先进行柚苷酶的脱苦比在发酵结束后效果要更佳。当0.06%果胶酶和0.02%PVPP酶的组合时澄清效果最好，透光率为90.6%。