调脂方对ApoE-/-小鼠动脉斑块及端粒酶—端粒系统的影响*

刘永源 梁东辉 林 敏 张 薇 黄曼萍 彭春丽

1 南方医科大学珠江医院中医科,广东省广州市 510280； 2 广州市花都新街社区卫生服务中心

动脉粥样硬化(Atherosclerosis，AS)引起的心脑血管疾病是威胁人类健康的重要疾病。血脂代谢紊乱是AS形成的重要因素。研究表明血脂异常在AS早期起着重要作用，在早期及时对血脂异常人群进行干预，有助于预防AS形成，降低心血管疾病的发病风险[1]。近年来对端粒酶—端粒系统的研究提示端粒功能失调与AS有着密切的关系，由端粒缩短引起的局部内皮细胞复制衰老和功能障碍在冠状动脉粥样硬化始动环节中发挥重要作用，而在AS晚期，端粒和端粒酶可能参与斑块中平滑肌细胞的衰老，进而诱导斑块破裂[2]。调脂方为我院中医科梁东辉教授经验方，入选为国家中医药管理局“十一五”重点专科、重点病种协作组制定的高脂血症诊疗方案中的调脂协定基础方，临床观察研究显示对血脂调节疗效显著[3]，方中的主药主要有效成分提取物丹参总酚酸、山楂总黄酮配伍可增强降脂和抗氧化效应，具有协同增效作用[4]。本研究旨在观察调脂方对ApoE-/-小鼠血脂、炎症因子及端粒酶—端粒系统的影响，探讨调脂方抗AS的可能机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物和造模、分组 根据研究需要以30只雄性ApoE-/-小鼠作为研究对象，平均周龄(8.2±1.3)周，体重(200±20)g，在我院心脏中心实验室饲养。造模前给予小鼠基础饲料适应性喂养2周后，数字表法随机分为模型组、阿托伐他汀组、中药干预组，每组10只。另取同周龄雄性C57BL/6小鼠10只作为空白对照组。小鼠均由南京建成生物工程研究所提供，合批号：20080613。

1.2 方法

1.2.1 喂养方法：空白对照组用普通饲料喂养；30只ApoE-/-小鼠均全程给予特制的高脂饲料(78.85% 原粮 +21% 猪油 +0.15% 胆固醇)喂养，共24周。模型组10只ApoE-/-小鼠从高脂饲料喂养12周后开始灌服蒸馏水，1次/d。中药干预组10只ApoE-/-小鼠从高脂饲料喂养12周后开始灌服中药调脂方，1次/d，持续时间为12周。调脂方组成：泽泻30g、丹参15g、决明子12g、何首乌15g、郁金12g、山楂15g。给药剂量为17.34g/(kg·d)标准灌胃给药，以上药物由本院中药房1次性购齐并鉴定，按水提醇沉法,制成颗粒，用蒸馏水溶解后给中药干预组小鼠灌胃给药。阿托伐他汀组10只ApoE-/-小鼠从高脂饲料喂养12周后开始以阿托伐他汀钙8.22mg/(kg·d)灌胃给药，1次/d，持续时间为12周。每只小鼠饲养环境相同(饲养条件SPF级,室温22～24℃, 相对湿度为50%,光照时段为7:00—19:00)，均自由饮水。

1.2.2 取材：所有小鼠实验饲养24周达到实验时间后取材，取材前小鼠禁食12h，无菌条件下，将小鼠麻醉后摘眼球取血，3 000rpm离心15min 分离血清。将小鼠处死后打开腹腔和胸腔，轻轻沿主动脉瓣至髂动脉分支处剥离全长主动脉，用于制备石蜡切片。

1.3 指标检测

1.3.1 血脂、炎症指标检测：送我院检验科，运用生化仪检测脂代谢指标：总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白(LDL)、高密度脂蛋白(HDL)及炎症指标:超敏C反应蛋白(hs-CRP)、白介素-6(IL-6)。

1.3.2 采用进行油红“O”染色，观察斑块形成及脂质堆积程度：实验末小鼠处死后，各组小鼠行主动脉冷冻切片油红“O”染色:(1)硅化载玻片粘取冷冻切片，切片干燥后入60%异丙醇浸洗10min。(2)油红“O”工作液染色10min。(3)60%异丙醇分化3～10s至间质清晰，水洗。(4)Mayer苏木精复染1min，自来水返蓝。(5)滤纸小心吸干水分，甘油明胶封片。依据每个标本连续切片的染色结果，选择AS斑块面积最大的切片做病理形态学分析。

1.4 外周血白细胞端粒酶—端粒检测

1.4.1 提取外周血白细胞RNA：严格按照无菌操作要求及说明书中操作步骤提取外周血白细胞RNA，采集小鼠肝素抗凝血，在其中加入等量淋巴细胞分离液混合，以2 000转/min作离心处理，时间20min。将悬浮物去除，从中单独将白细胞层分离出来，按照1∶3比例加入生理盐水混匀，再次离心将上清液完全去除，采用0.01M的磷酸盐缓冲液洗涤2次，在沉淀中加入1ml TRISzol。在含有1ml DEPC水的试管中加入10μl RNA，检测波长为260mm的吸光度，计算RNA浓度。

1.4.2 提取DNA：经TRIzol提取外周血白细胞RNA后，在剩余的界面相、酚相中提取DNA，具体操作方法为：分别在DNA所在界面相、酚相中添加300μl无水乙醇，反复离心2次，转速、时间同上，将悬浮物取出后在沉淀中加入乙醇，以0.01M的磷酸盐缓冲液反复冲洗，放置在30℃室温孵育。20min后干燥，处理完成后加入50μl DEPC水，溶解沉淀。DNA浓度(μg/ml)=50×A260×稀释倍数/1 000。

1.4.3 设计引物：参考雷大洲等[5]与陈君柱等[6]研究成果，以36B4为参照基因，采用Primer 5.0进行Foreard、Telomerase、Internal control gene端粒、端粒酶引物序列检索。

1.4.4 PCR：参照试剂说明书配置20μl：2×SYBR Premix Ex Taq 10μl PCR(荧光定量)反应体系，参数设置：上游引物、下游引物、Cdna、dH2O 分别为1μl、1μl、2μl、6μl。根据T(定量PCR中端粒)/S (单个拷贝的基因)得出端粒长度数值，且与端粒平均长度呈正相关。

2 结果

2.1 血脂及炎症指标 与空白对照组比较，模型组血清脂代谢指标中TG、 TC、LDL和炎症指标hs-CRP、IL-6均明显升高(P<0.01)，提示造模成功。与模型组比较，阿托伐他汀组TC、LDL、HDL、hs-CRP显著下降(P<0.01)，TG、IL-6亦下降明显(P<0.05)；中药干预组TG、TC、HDL、 hs-CRP、IL-6显著下降(P<0.01)，LDL亦明显下降(P<0.05)；与阿托伐他汀组比较，中药干预组降低TC的作用较弱(P<0.05)，而中药干预组在降低TG程度上优于阿托伐他汀组(P<0.05)，在降低LDL、hs-CRP、IL-6及升高HDL上无明显差异。见表1。

表1 各组血脂水平及炎症指标指

注：#P<0.01 VS空白对照组；△P<0.05、☆P<0.01 VS 模型组；▲P<0.05 VS中药干预组。

2.2 主动脉病理 光镜(×250nm)下可见：本研究空白对照组中小鼠主动脉各层排列整齐，结构清晰，细胞形态良好，少见皱褶、空泡，主动脉根部内膜有增厚现象，但无AS病灶，见图1A；从图1B可见，小鼠主动脉血管内皮细胞伴有明显异常征象，如厚度增加、血管壁周径缩小、断裂等，炎性病灶范围增加，动脉粥样硬化区域脂质呈鲜红色，细胞核呈蓝色，间质无色，提示存在AS病变；AS斑块压迫、平滑肌细胞萎缩、弹力纤维破坏，中膜逐渐变薄；在薄纤维帽之下可见大量不定形坏死崩解产物、呈针状空隙的胆固醇结晶；肌层排列紊乱，血管壁变薄、层次结构不清晰，而中药干预组图1C和阿托伐他汀组图1D虽同样存在AS斑块，但程度较模型组明显改善。

A B C D

图1主动脉病理光镜(×250nm)图

A.空白对照组，B.模型组，C.中药干预组，D.阿托伐他汀组

2.3 外周血白细胞端粒长度、端粒酶活性 模型组外周血白细胞端粒长度明显短于空白对照组、外周血白细端粒酶活性低于空白对照组(P<0.05)。与空白对照组比较，中药干预组端粒酶活性、阿托伐他汀组端粒长度、端粒酶活性明显提高(P<0.01)，中药干预组端粒长度亦有提高(P<0.05)。与模型组比较，中药干预组与阿托伐他汀组外周血白细胞端粒长度、端粒酶活性均明显提高(P<0.01)，中药干预组与阿托伐他汀组之间外周血白细端粒长度及端粒酶活性则无明显统计学差异。见表2。

3 讨论

表2 各组端粒长度、端粒酶活性

注：#P<0.05、□P<0.01VS 空白对照组；☆P<0.01 VS模型组。

AS是众多心脑血管疾病共同的病理基础，严重危害人类健康。血脂代谢紊乱是AS形成的重要因素，研究表明血脂异常在AS早期起着重要作用，在早期及时对血脂异常人群进行干预，有助于预防AS形成，降低心血管疾病的发病风险[1]。调脂方为我院中医科梁东辉教授经验方，入选为国家中医药管理局“十一五”重点专科、重点病种协作组制定的高脂血症诊疗方案中的调脂协定基础方，临床观察研究显示对血脂调节疗效显著[3]，方中主药的主要有效成分提取物丹参总酚酸、山楂总黄酮配伍可增强降脂和抗氧化效应，具有协同增效作用[4]。本研究结果表明，中药干预组小鼠灌服调脂方后脂代谢指标、炎症指标较模型组明显改善，降脂幅度虽略低于阿托伐他汀组，但差异无统计学意义；在病理形态上观察，调脂方对模型小鼠主动脉AS病变亦较模型组明显改善，以上结果提示调脂方具有类似于他汀类药物调节脂代谢、炎症指标及干预AS病变作用。病理形态上调脂方对AS斑块影响不及阿托伐他汀考虑与中药起效作用较缓有关，但在调节高密度脂蛋白上，调脂方有升高高密度脂蛋白趋势。

端粒是短的多重复的非转录序列(TTAGGG)及一些结合蛋白组成特殊结构，能够保护染色体末端免于融合和退化、提供非转录DNA的缓冲物，在染色体定位、复制、细胞凋亡、细胞转化等生命活动中发挥着重要的作用。端粒酶是一种由RNA和蛋白质组成的特殊反转录酶，与真核生物细胞DNA末端的端粒合成明显相关，正常状态下体细胞端粒长度会随着细胞分裂逐渐缩短，同时端粒酶活性增强，促使细胞增殖。近年来对端粒酶—端粒系统的研究提示端粒功能失调与AS有着密切的关系，另外发现端粒长度改变是诱发心脑血管疾病患者血管内皮细胞衰老、障碍的独立危险因素，随着疾病进展，上述两者相互作用可影响血管斑块中平滑肌细胞，诱导其加快衰老[2]。Matthews等[7]研究报道，心脑血管疾病患者病变位置平滑肌细胞端粒与正常人群相比明显异常缩短，且端粒越短，说明动脉粥样病变程度越高，临床给予他汀类药物治疗方案的出发点：即在于其药理机制能够作用于长外周血淋巴细胞端粒长度，从理论上而言具有可行性[8-9]。另外从心血管发病机制角度分析，端粒、端粒酶导致的血管内皮细胞损伤与炎性反应是共同产生的，在导致心功能障碍的同时，还会影响白细胞在血液循环中的含量。鉴于此，临床常采用白细胞检测的方法对心血管疾病进行筛查，具有方便易行、操作简单等特点，可通过检测外周血白细胞端粒长度反映疾病病变程度。多个流行病学研究探讨了外周血白细胞端粒长度与动脉粥样硬化性血管疾病发生风险的关系[10]。本研究结果显示AS模型小鼠外周血白细胞端粒长度缩短、端粒酶活性降低，提示端粒酶—端粒系统参与了AS过程；经调脂方及他汀药物治疗后外周血白细胞端粒长度、端粒酶活性较模型组明显改善，而且高于空白对照组，但AS斑块尚未能达到空白对照组水平，考虑与AS为多因素共同作用结果有关，端粒酶—端粒系统在AS过程的作用机制有待进一步深入研究，方能助于心血管疾病治疗和预防中提供新靶点。