咪唑类离子液体在桤叶棠棣总黄酮提取工艺中的应用

潘思源 田英姿

摘要 [目的]以提取率为主要评价指标，探讨咪唑类离子液体提取桤叶棠棣总黄酮的最佳工艺。[方法]通过对比不同种类、浓度的提取溶剂和不同提取方法初步确定提取工艺，并应用单因素试验和响应面Box-Behnken试验对关键因素进行优化。[结果]选取0.7 mol/L的溴化1-丁基-3-甲基咪唑水溶液为提取溶剂，其提取效率高于其他离子液体及70%甲醇、70%乙醇等传统有机溶剂；微波辅助法相比热回流法和超声辅助法具有显著优越性，提取得率高且可重复性好。在微波提取工艺的响应面试验中，液料比对桤叶棠棣总黄酮提取率的影响最为显著，最佳工艺条件：提取温度72 ℃、提取时间16.5 min、液料比24.5（mL∶g），在此条件下平均得率达12.75 mg/g。[结论]咪唑类离子液体在微波环境下能够有效提高桤叶棠棣总黄酮提取率，优化后的工艺参数可为其工业化生产和科学研究提供理论依据。

关键词 桤叶棠棣；总黄酮；离子液体；提取工艺；响应面

中图分类号 R282.4 文献标识码 A

文章编号 0517-6611（2019）09-0159-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.09.046

Abstract [Objective] The extraction rate was the main evaluation index， and the optimal extraction process for total flavonoids of Amelanchier alnifolia Nutt. was studied. [Method] The initial extraction process was determined by comparing different extraction methods and extraction solvents of different types and concentrations. The key factors were optimized by single factor tests and BoxBehnken tests. [Result] 0.7 mol/L 1butyl3methylimidazolium bromide was selected as the extraction solvent， and the extraction efficiency was higher than other ionic liquids， 70% methanol， 70% ethanol and other traditional organic solvents；compared with the thermal reflux method and the ultrasonicassisted method， the microwaveassisted method has significant superiority， such as high extraction yield and good repeatability. In the response surface test of microwaveassisted extraction process， materialliquid ratio had the most significant effect on the extraction rate of total flavonoids of Amelanchier alnifolia Nutt.， and the optimum conditions were as follows： extraction temperature 72 ℃， extraction time 16.5 min， liquidsolid ratio 24.5 mL/g， the average yield in repeated extraction of three times could reach 12.75 mg/g. [Conclusion] The imidazole ionic liquid under microwave condition can effectively improve the extraction rate of total flavonoids from Amelanchier alnifolia Nutt.. The optimized parameters in extraction process can provide corresponding theoretical basis for industrial production and scientific research.

Key words Amelanchier alnifolia Nutt.；Total flavonoids；Ionic liquid；Extraction process；Response surface method

榿叶唐棣（Amelanchier alnifolia Nutt.）是一种发展迅速、风味独特的蔷薇科小浆果，原产自北美洲中西部，现已引种至我国新疆、甘肃、吉林等省份[1]。桤叶棠棣果实富含抗氧化剂、水果膳食纤维及钙、磷、镁、锰等人体所需矿物元素，近年来作为功能性食品被广泛关注，需求量也日渐上涨[2]。研究表明，黄酮类化合物是桤叶棠棣成熟果实中抗氧化剂的主要成分，包括黄酮醇类、黄烷类（聚合度不同的原花青素）和花青素等，在人体血压控制和消炎抗癌方面功效突出，药用价值极其可观[3-4]。目前，国内对桤叶棠棣的研究仅限于种植栽培[5]、酿造工艺[6-7]和果胶[8]、花青素[9]、花色苷[10]等活性成分方面，开发其总黄酮的提取工艺意义重大，提取产物可广泛应用于食品、医药及保健品领域。

研究表明，离子液体（Ionic liquids，IL）能替代传统有机溶剂提取植物资源中的黄酮类化合物，提取率高且绿色环保，其中咪唑类离子液体的萃取效果最为显著。Dróz·dz·等[11]用3种咪唑类离子液体提取石楠花总黄酮，提取率远高于60%乙醇溶液和乙酸乙酯。Wang等[12]从15种结构不同的离子液体中选择提取效率最佳的溴化1-丁基-3-甲基咪唑（[Bmim]Br）用于超声辅助法提取毛竹叶总黄酮。杜芳艳等[13]将[Bmim]Br离子液体和微波提取工艺相结合提取海红果渣总黄酮，提取时间及溶剂消耗量大幅减少。

为此，笔者以咪唑类离子液体的水溶液（甲醇溶液、乙醇溶液和乙酸乙酯）为提取溶剂，采用不同方法提取桤叶棠棣总黄酮（total flavonoids of Amelanchier alnifolia Nutt.，TFAN），依据提取得率筛选出最合适的提取工艺，并设计单因素和响应面试验进行优化，对TFAN的实际生产具有一定参考作用，同时为其功能性产品的研发奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

桤叶棠棣：水西沟2号，引种自加拿大，采自新疆乌鲁木齐县。芦丁标准品（HPLC≥98%），源叶生物公司；[Bmim]Br、溴化1-己基-3-甲基咪唑（[Hmim]Br）、溴化1-辛基-3-甲基咪唑（[Omim]Br），纯度均≥97%，阿拉丁公司；其他试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

MCR-3常压微波化学反应器，贝仑仪器公司；ALPHA2-4 LSC实验室冻干机，德国Marin Christ公司；UV-2600紫外可见分光光度计，岛津公司；TGL20MC高速冷冻离心机，英泰仪器公司；LK-2000A中药高速粉碎机，精胜仪器公司；超声波清洗器、恒温水浴锅、分析天平、真空泵等实验室常用仪器。

1.3 方法

1.3.1 原料预处理。筛选出大小均一的桤叶棠棣鲜果，清洗风干后放入粉碎机中切开，充分粉碎。将粉碎后的原料完全转移至冷冻干燥机中连续处理16 h，再次粉碎脱水原料，过60目筛，装袋封口置于干燥、低温环境下贮存。

1.3.2 桤叶棠棣总黄酮的提取及测定。

1.3.2.1

TFAN的提取步骤。用分析天平称取桤叶棠棣粉末样品1.000 g，置于150 mL圆底三口烧瓶中，按预先设定的液料比加入提取溶剂，分别采用热回流、超声辅助及微波辅助工艺提取TFAN。若提取溶剂为咪唑类离子液体的水溶液，则在提取结束后进行冷冻离心及针式滤器压滤处理；若提取溶剂为其他3种有机溶剂，则直接转移至坩埚式滤器中充分抽滤。用对应种类和浓度的提取溶剂将滤液定容至50 mL，作为TFAN待测液备用。

1.3.2.2

芦丁标准曲线的绘制。参照杨润亚等[14]的方法，芦丁标准品的浓度为0.25 mg/mL，采用“NaNO2-Al（NO3）3-NaOH”显色体系和紫外可见分光光度计测定芦丁标准曲线（λ=510 nm处有最大吸收峰）。

1.3.2.3

TFAN提取率的测定。用移液枪移取TFAN 待测液2.0 mL，按照“1.3.2.2”中的方法依次加入显色体系所用试剂并摇匀、静置，显色处理完成后在510 nm波长处测定其吸光度，代入回归方程求出相应的总黄酮质量m0（mg）。测定过程中以60%乙醇溶液为校准液，经全波长扫描，咪唑类离子液体的水溶液及3种有机溶剂在此波长下均无吸收峰，对待测液中黄酮类化合物质量的测定无干扰。TFAN提取率计算公式：Y=（25×m0）/m1。式中，Y为TFAN提取率（mg/g），25为定容待测液体积与转移待测液体积之比，m1为桤叶棠棣粉末样品的质量（g）。

1.3.3

提取溶剂种类及浓度的选择。采用微波辅助法提取TFAN，不同提取溶剂的用量均为20 mL，设定反应条件为提取功率400 W、提取温度60 ℃、提取时间20 min，依据TFAN提取率及过滤操作的难易程度筛选出最佳溶剂种类。溶剂分别为70%甲醇溶液、70%乙醇溶液、乙酸乙酯、[Bmim]Br溶液、[Hmim]Br溶液、[Omim]Br溶液（离子液体浓度均为0.6 mol/L）。用超纯水将该溶剂配制成一定浓度梯度（0.4～1.2 mol/L）的溶液，在上述提取条件下分别提取TFAN，提取率最高的浓度用于后续试验。

1.3.4 不同提取方法的比较。设定热回流法、超声辅助法及微波辅助法的工艺参数[15]，用“1.3.3”中所确定的提取溶剂分别提取TFAN，各方法重复3次，通过评价TFAN提取率、提取耗时、相对标准偏差等参考指标确定最佳提取方法。为了使提取过程稳定、快速升温，且不破坏黄酮类化合物的结构和活性，试验所用超声波及微波的功率均为400 W[16]。

1.3.5

单因素试验设计。以上述最佳提取方法为研究对象，将提取温度（40～90 ℃）、提取时间（5～30 min）、液料比[10∶1～35∶1（mL∶g）]作为单因素试验的3个因素，分别研究各因素对TFAN提取率的影响规律和优势水平。

1.3.6

Box-Behnken试验设计。根据“1.3.5”中的结果设计响应面试验优化提取工艺，TFAN提取率为响应值（Z），具体因素及水平见表1。

2 结果与分析

2.1 芦丁标准化曲线

芦丁标准品质量M与吸光度A的回归方程为A=1.1664M-0.0061（R2=0.998 7），在0.05～0.50 mg时可用于TFAN的定量测定（图1）。

2.2 提取溶剂的确定

2.2.1 溶剂种类对桤叶棠棣总黄酮提取率的影响。由图2可知，70%甲醇溶液的提取率为7.03 mg/g，虽比70%乙醇溶液和乙酸乙酯高，但不及3种浓度为0.6 mol/L的咪唑类离子液体溶液，一方面是因为离子液体对TFAN的溶解能力比传统有机溶剂强，另一方面是因为离子液体可以溶解植物细胞壁中的纤维素，促使有效成分释放至细胞外。此外，[Bmim]Br溶液的提取率达8.75 mg/g，高于[Hmim]Br溶液和[Omim]Br溶液，可能是因为较长的阳离子烷基链带来了更大的空间位阻效应和传质阻力，离子液体对细胞壁的破坏能力也有所减弱，在降低提取率的同时还增大了针式过滤操作所需的压力，且链长越长过滤速度越慢[15]。因此，選择TFAN提取率最高、便于过滤的[Bmim]Br溶液作为提取溶剂。

2.2.2 [Bmim]Br浓度对桤叶棠棣总黄酮提取率的影响。由图3可知，当[Bmim]Br溶液浓度从0.4 mol/L增大到0.7 mol/L时，溶剂中主要起溶解和传质作用的离子液体不断增多，TFAN提取率随之升高。继续增大溶液浓度，TFAN提取率逐步下降，考虑到[Bmim]Br离子液体呈高度黏稠状，浓度越大导致提取溶剂的黏度越大，较强的传质阻力会抑制TFAN溶出。另外，由相似相溶原理可知，[Bmim]Br溶液的极性越接近于桤叶棠棣总黄酮中主要物质的极性范围，则TFAN的溶解和溶出程度越大，表现出较高的提取效率，而提取溶剂的浓度是决定其极性大小的关键因素之一[17]。综合以上因素，选取[Bmim]Br溶液的浓度为0.7 mol/L，此时TFAN提取率有最大值10.33 mg/g。

2.3 3种提取方法的比较

由表2可知，传统热回流法的TFAN提取率最低，且提取过程耗时长、反应所需温度高、工艺较为繁琐。另外，在相同工艺参数下，超声辅助法的TFAN

提取率比微波輔助法低0.64 mg/g，且RSD值高1.3%，多次

提取的重复性差。造成这一结果的原因可能是离子液体与微波间的热效应比超声波协同作用强，升温和控温过程也更为稳定，为黄酮类化合物的溶出提供了有利条件，故微波辅助法较其他2种方法具有显著优越性。

2.4 单因素试验结果

2.4.1

提取温度对桤叶棠棣总黄酮提取率的影响。固定提取时间20 min、液料比20∶1（mL∶g），测定提取温度40、50、60、70、80、90 ℃时的TFAN提取率，结果见图4。由图4可知，当微波提取的设定温度从40 ℃增大到70 ℃时，黄酮类化合物的运动速率不断加快，在离子液体中的溶解性及扩散程度提高，TFAN提取率随之上升。但继续升高温度导致TFAN提取率有所降低，这是因为在高温环境下结构相对不稳定的TFAN会被氧化，温度越高氧化程度越大，同时有悖于提取过程“节能降耗”的发展方向。故选择提取温度60～80 ℃为该因素在响应面试验中的水平。

2.4.2

提取时间对桤叶棠棣总黄酮提取率的影响。固定提取温度60 ℃、液料比20∶1（mL∶g），测定提取时间5、10、15、20、25、30 min时的TFAN提取率。结果见图5。由图5可知，在15 min前TFAN提取率随时间延长迅速上升，主要与TFAN在不同时间点的溶出程度有关，达到完全溶出需要一定反应时间。提取时间继续延长，TFAN提取率呈缓慢下降趋势，这是因为微波的强热效应会破坏部分TFAN的内部结构，处理时间越长，被分解的黄酮类化合物越多。故选择提取时间10～20 min为该因素在响应面试验中的水平。

2.4.3 液料比对桤叶棠棣总黄酮提取率的影响。固定提取温度60 ℃、提取时间20 min，测定液料比10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1、35∶1（mL∶g）时的TFAN提取率，结果见图6。由图6可知，TFAN提取率随液料比的增加先上升后降低，当液料比为25∶1（mL∶g）时提取率最大。溶剂的增加会使TFAN在离子液体中的溶解更加充分，传质速率及溶出速率加快；但溶剂过多会导致微波升温过程减慢、杂质溶出量增加，不仅使TFAN提取率大幅降低，还增加了生产成本和过滤操作的难度。故选择液料比20∶1～30∶1（mL∶g）为该因素在响应面试验中的水平。

2.5 响应面试验结果

Box-Behnken试验结果见表3，运用Design-Expert软件进行二次回归拟合，建立自变量提取温度（X1）、提取时间（X2）和液料比（X3）与响应值TFAN提取率（Z）的数学模型，所得回归方程：

Z=12.62+0.20X1+0.31X2-0.39X3+0.038X1X2+0.059X1X3-0.021X2X3 -0.52-0.55-1.80

ANOVA分析结果见表4。由表4可知，模型整体具有统计学意义，达极显著水平（P<0.000 1）；失拟项不显著（P>0.05）表明模型稳定，不易受外界因素影响；变异系数CV=

1.34%和决定系数R2Adj=0.981 5表明模型的拟合度与精确度较高，可替代具体试验分析此工艺中TFAN提取率的变化。X1、X2、X3及其二次项均为极显著因素，对TFAN提取率均影响较大；3个交互项不显著，说明因素间两两相互作用对试验结果的影响较弱。根据结果差异性（P）及方程一次项系数的绝对值判断，各因素对TFAN提取率的影响表现为液料比（X3）>提取时间（X2）>提取温度（X1）。

由图7可知，TFAN提取率的最高值均分布在各因素所选取的水平范围内，因此该模型可用来预测的极值点所在位置。沿液料比方向，3D曲面的陡峭程度最大，且等高线分布最为密集，故液料比对TFAN提取率的影响较其他2个因素更为显著；对比各图中等高线的形状，提取温度和液料比的等高线呈椭圆形且弧度最大，说明X1X3的交互作用强于X1X2和X2X3，但仍未达显著水平[18]。

由回归方程可得微波辅助法的理论最佳工艺条件：提取温度72.02 ℃、提取时间16.46 min、液料比24.46（mL∶g），TFAN提取率为12.71 mg/g。根据实验室仪器精度，将工艺修正为提取温度72 ℃、提取时间16.5 min、液料比24.5（mL∶g），重复提取3次进行验证，TFAN提取率为12.75 mg/g，RSD为0.72%，与理论值基本吻合。

3 结论

采用不同种类和浓度的溶剂提取桤叶棠棣总黄酮，咪唑类离子液体水溶液较传统有机溶剂表现出更好的提取特性，尤其是浓度0.7 mol/L[Bmim]Br溶液。对比3种提取方法，微波辅助法的提取效率高于热回流法及超声辅助法，离子液体在微波环境下所产生的强热效应更有利于黄酮类化合物的溶出。

通过单因素和Box-Behnken试验研究微波辅助[Bmim]Br溶液提取榿叶棠棣总黄酮，所得最佳提取工艺为提取温度72 ℃、提取时间16.5 min、液料比24.5（mL∶g），验证试验的平均提取得率为12.75 mg/g，与回归方程的预测结果相符，模型可靠性高。在选取的3个独立因素中，液料比对提取率的影响最为显著（P=0.000 2），是该工艺中的关键性因素。

该研究针对桤叶棠棣总黄酮提供了一种高效、绿色的提取工艺，对其分离纯化、成分分析、功能特性、开发应用等研究具有一定借鉴意义，且咪唑类离子液体可通过反萃取法进行回收，规避了自身价格高昂所带来的生产成本。

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