樟树成熟种子超低温保存研究

马健 叶润燕 张俊红

摘要 [目的] 研究樟树成熟种子保存的最佳方法。[方法]利用正交试验对樟树种子进行超低温保存，探讨樟树成熟种子保存的最佳方法。[结果]樟树种子超低温保存过程中种子最佳含水量为26%；在樟树种子超低温保存过程中，15%二甲基亚砜是最好的冷冻保护剂之一；最利于樟树种子超低温保存的解冻方式是慢冻和慢解冻。[结论]该研究为研究樟树种子低温保存提供理论依据。

关键词 樟树；超低温；保存

中图分类号 S792.23 文献标识码 A

文章编号 0517-6611（2019）09-0170-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.09.049

Abstract [Objective] To study the best method and conditions to protect the seed activity of Cinnamomum camphora Presl in the process of seed preservation. [Method] The seeds of C.camphora were cryopreserved by orthogonal test， and the conductivity of the preserved seeds and the dehydrogenase in vitro were determined. [Result] 26% was the optimal water content of camphor seeds in the process of cryopreservation. 15% dimethyl sulfoxide was one of the best cryoprotectants in the cryopreservation of C.camphora . Slow freezing and slow thawing were the most favorable methods for the cryopreservation of seeds. [Conclusion] This study could provide theoretical basis for the study on the cryopreservation of C.camphora seeds.

Key words Cinnamomum camphora Presl；Ultralow temperature；Conservation

隨着原始森林面积的锐减，大量物种种质资源不断流失，尤其是木本种植资源，所以对木本种植资源的保存开始受到越来越多的关注。种子作为木本植物种质资源保存最普遍也是最佳的保存材料之一，在珍稀树种种植资源的保存中发挥着越来越大的作用。但珍稀树种的种子大多为顽拗性种子，目前采用常规方法难以长期保存，而超低温保存则多次在顽拗性种子中获得成功[1-4]。笔者采用正交试验对樟树种子进行超低温保存，并对其保存后的种子进行电导率测定以及对其离体胚进行脱氢酶测定，探讨在保存过程中最利于保护种子活性的方法和条件，以期为实现樟树种子长期贮藏提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

试验所用种子为20～30年生，生长健壮、无病虫害的优良樟树单株上采摘的成熟果实。

1.2 含水量测定

1.2.1 绝对含水量测定。根据国际林木种子检验规程（SIAT）的规定，采用105 ℃烘干8 h来测定绝对含水量。

ω0=（鲜重-绝干重/鲜重）×100%

1.2.2 实际含水量测定。每组选择大小均匀、颗粒饱满、无损伤的樟树种子10颗，每个梯度测定3组，共12组，放入30 ℃烘干箱中加硅胶使种子失水至实际含水量分别为33%、26%、20%、14%。试验同时测定种子的绝对含水量，失水过程中经常更换硅胶。实际含水量采用减重法计算：ω1=100%-[最初重量×（100%-相对含水量）]/最后重量。

1.3 冷解冻程序 樟树种子超低温保存的冷解冻程序如图1所示。

1.4 相对电导率的测定

选择大小均匀、颗粒饱满、无损伤的种子10颗，称重后用自来水冲洗，再用蒸馏水冲洗数次，用滤纸吸干浮水，分别装入50 mL试管中加入10 mL重蒸水浸泡，再用DDS-307型电导率仪先测定电导值，即为初始值（a1），此后每隔4 h测定电导率（a2），同时记录水温，直至24 h结束。然后，将浸泡液连同种子在沸水中煮15 min，冷却至25 ℃后再测定电导率（a3）。以不加种子的重蒸水为空白对照。按以下公式计算绝对电导率：

绝对电导率（μS/cm）=（种子电导率测定值-空白对照的电导率）×电极常数[5]；

然后，换算为25 ℃时电导率：25 ℃电导率=电导率×[1+0.02 ×（t-25）][6]；按以下公式计算相对电导率：相对电导率Sr（%）=S1/S2×100，式中S1为25 ℃电导率，S2为绝对电导率。

1.5 脱氢酶活性（TTC含量）的测定

取待测种子3个重复，每重复20粒种子，在45 ℃温水中浸种24 h（以增强离体胚的呼吸强度，使其迅速显色），取胚放入10 mL试管中，加入5 mL 0.1%TTC溶液，加盖，在37 ℃黑暗条件染色8 h，充分染色后，倒出TTC 溶液，并用蒸馏水冲洗3次。然后，再将样品中加入丙酮及少许石英充分研磨。将研磨液倒入2 mL的试管中，用丙酮定容。将试管置于4 000 r/min下离心10 min。取上清液在490 nm波长下使用72-1型分光光度计测定光密度（OD）值，根据标准曲线查找相应还原态的TTC含量。

1.6 试验设计

按L16（42×25）正交试验设计，含水量33%、26%、20%、14%共4个不同水平梯度；冷冻方式包括快速冷冻和慢速冷冻；解冻方式包括快速解冻和慢速解冻；冷冻保护剂有二甲基亚砜、蔗糖和乙二醇，质量分数均为5%、10%、15%、20%和5%、10%，试验设计方案见表1～2。

2 结果与分析

2.1 不同含水量对樟树成熟种子超低温保存的影响

细胞结构的完整性是种子活力的基础[7]，当种子老化劣变时，细胞膜受到损伤甚至解体，膜透性增大，电解质外渗，水浸液电导率上升[8]，所以测定的相对含水量越大，其种子活性越低。脱氢酶是种子呼吸过程中一种重要的还原酶，其活性与种子的发芽力密切相关[9]，与种子的呼吸强度呈正相关，而OD值能反映脱氢酶的活性，TTC含量越高，种子活性越强。

由表3和表4可知，无论是相对电导率测定还是TTC含量测定，其中B（含水量）的R值最大，含水量对二者的影响极显著，这说明在种子超低温保存过程中含水量的影响最显著。B2和B3即当种子含水量为20%～26%时，种子经过超低温保存后活性较高。LSD比较结果表明，B2和B3对结果的影响极显著。综合考虑，樟树种子超低温保存过程中种子最佳含水量为26%。

2.2 不同冷解冻方式对樟树成熟种子超低温保存的影响

表3中通过对相对电导率的级差分析发现，冷解冻方式的R值分别为31.38和17.86，说明冷解冻方式对樟树种子超低温保存相对电导率有极大影响。表4中冷冻方式的R值为12.21，P<0.05，影响达到显著水平，而解冻方式对结果的影响不显著，说明仅冷凍方式对樟树种子超低温保存TTC含量有较大影响。

表3中C2（即慢冻方式）的超低温保存种子的相对电导率较小，种子活性较高；表4中慢冻方式的超低温保存过程后TTC含量较高，种子活性较高。表3中解冻方式K1>K2，表明D2即慢解冻方式种子经超低温保存后相对电导率较低。综上所述，最利于种子超低温保存的解冻方式为慢冻和慢解冻。

2.3 不同冷冻保护剂对樟树成熟种子超低温保存的影响

通过方差分析发现，无论测定相对电导率还是TTC含量，E和F因素的P值均大于0.05，所以该试验中冷冻保护剂的蔗糖和乙二醇含量对樟树种子超低温保存的影响不大。A因素的方差分析P值均小于0.05，说明A因素（二甲基亚砜含量）对樟树种子超低温保存的影响显著。

表3中A因素的K3值最小，说明A3的相对电导率值较低，通过LSD分析发现A3和A2、A4的P值分别为0.003和0.018；A3和A1的P值为0.401，影响不显著。这表明二甲基亚砜含量为A1或A3（即5%或15%）时，种子经过超低温保存后活性较高。表4中通过LSD比较发现A3和A1的P值为0.023，影响达到显著水平，说明在樟树种子超低温保存过程中A3因素（即15%的二甲基亚砜）比二甲基亚砜含量为5%时能更好地保护种子活性。综合考虑，在樟树种子超低温保存过程中，15%二甲基亚砜是最好的冷冻保护剂。

3 讨论

通过正交试验对樟树种子超低温保存后相对电导率和脱氢酶活性（TTC含量）进行测定，结果发现贮藏材料（包括种子和离体胚）的含水量是超低温保存成功与否的关键因素，尤其是在顽拗性种子的超低温保存过程中，适度脱水能在超低温冷冻或解冻过程中避免或减轻低温伤害，是超低温保存成功的关键[10-12]。冷冻方式和解冻方式的选择则是对超低温保存过程中剧烈降温和升温的控制，是超低温保存的辅助手段。冷冻保护剂在超低温过程中对剧烈温度变化有很好的缓冲作用，但由于冷冻保护剂本身对材料有毒害作用，所以适宜的种类和浓度是冷冻保护剂选择的关键。该研究探讨了樟树种子超低温保存的最佳条件，结果发现适度脱水至含水量为26%时的樟树种子在含15%二甲基亚砜的冷冻保护剂保护下，经过慢冷冻和慢解冻的方式在超低温保存过程中能最大限度减少细胞损伤，保持种子活性。

目前超低温保存作为一种重要的种子保存技术，具有十分广阔的应用前景。尤其是对顽拗性种子而言，超低温保存因其操作简便、投入少，保存种子遗传稳定、易出现抗寒新品种等优点成为最佳贮藏手段。成功保存顽拗性种子的报道也不断出现[3，13]，但总体来说研究工作尚处于起步阶段，种子超低温保存还存在许多问题有待解决，如保存后的存活率低、正常成苗困难等。

参考文献

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