亚胺培南异质性耐药阴沟肠杆菌的临床特征和感染危险因素调查

周妍君　贾晓炯　何建春　夏云

[摘要] 目的 探究亞胺培南异质性耐药阴沟肠杆菌的临床特征和感染危险因素。 方法 采用病例对照研究，收集2014年1月～2016年12月重庆医科大学附属第一医院住院患者无菌体液标本中分离的非重复阴沟肠杆菌138株，其中阴沟肠杆菌亚胺培南异质性耐药菌株作为实验组（115株），非异质性耐药菌株作为对照组（23株）。采用K-B法进行异质性耐药初筛，PAP试验对异质性耐药现象加以确认，并用统计学方法对患者病例资料进行危险因素分析。 结果 收集标本中有115株（83.3%）阴沟肠杆菌对亚胺培南产生异质性耐药现象：从送检科室看，肝胆外科科室分离率最高为34.1%;从分离的标本类型看，多数来源于血液标本，分离率为35.5%。多因素分析结果显示：男性（OR = 3.40，95%CI：1.16～9.92）、导尿管（OR = 3.74，95%CI：1.25～11.24）、中心静脉置管（OR = 3.65，95%CI：1.22～10.89）以及碳青霉烯类抗生素使用（OR = 6.79，95%CI：1.48～31.14）是引起亚胺培南异质性耐药阴沟肠杆菌相关感染的独立危险因素（P < 0.05）。 结论 临床应严格把握抗菌药物的适应证，规范侵入性操作，从而减少耐药菌的出现和流行。

[关键词] 阴沟肠杆菌;亚胺培南;异质性耐药;危险因素

[中图分类号] R378          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-7210（2019）06（a）-0147-04

Study on clinical characteristics and risk factors for infection of Imipenem-heteroresistant Enterobacter cloacae

ZHOU Yanjun1   JIA Xiaojiong1   HE Jianchun1   XIA Yun2

1.The First Clinical College of Chongqing Medical University， Chongqing   400016， China; 2.Department of Laboratory， the First Affiliated Hospital of Chongqing Medical University， Chongqing   400016， China

[Abstract] Objective To investigate clinical characteristics and risk factors for infection of Imipenem-heteroresistant Enterobacter cloacae. Methods By means of case-control study， a total of 138 strains of Enterobacter cloacae isolated from the aseptic fluid samples of hospitalized patients from the First Affiliated Hospital of Chongqing Medical University from January 2014 to December 2016 were collected. Imipenem-resistant strains of Enterobacter cloacae were used as experimental group （115 strains） and non-heterogeneous drug-resistant strains as control group （23 strains）. The disk diffusion was used for screening heteroresistance and PAP test confirmed the heteroresistance. The risk factors of patients'case data were analyzed by statistical method. Results There were 115 strains （83.3%） showed heteroresistance to imipenem. The rate of separation of hepatobiliary department was 34.1%. From the type of isolated specimens， most of them were derived from blood samples and the isolation rate was 35.5%. The results of multivariate analysis showed that male （OR = 3.40， 95%CI： 1.16-9.92）， catheter （OR = 3.74， 95%CI： 1.25-11.24）， central venous catheter （OR = 3.65， 95%CI： 1.22-10.89） and use of carbapenem antibiotics （OR = 6.79， 95%CI： 1.48-31.14） were independent risk factors for infection of Imipenem-heteroresistant Enterobacter cloacae （P < 0.05）. Conclusion Clinical indications for antimicrobial agents should be strictly controlled and invasive procedures should be regulated to reduce the emergence and prevalence of heteroresistant bacteria.

[Key words] Enterobacter cloacae; Imipenem; Heteroresistance; Risk factor

阴沟肠杆菌（Enterobacter cloacae）是一种常见的发酵革兰阴性杆菌，是院内感染的重要条件致病菌之一，通常可引起皮肤软组织感染、泌尿道感染、呼吸道感染以及败血症等[1-2]。由于广泛应用广谱抗生素，多重耐药阴沟肠杆菌逐年增多，加之阴沟肠杆菌具有可移动的基因元件，耐药机制复杂，给临床诊治带来了巨大的挑战[3]。碳青霉烯类（Carbapenems）药物是一种新型β-内酰胺类抗生素，被认为是近年来治疗耐药革兰阴性菌感染的最后一道防线，其中亚胺培南是临床使用率最高的一种碳青霉烯类抗生素，具有抗菌谱广、抗菌作用强、有耐酶或抑酶特点，对革兰阴性杆菌具有较强杀菌作用[4-5]。自从1997年Hiramatsu等学者最早报道了万古霉素异质性耐药的金黄色葡萄球菌后[6]，细菌的异质性耐药现象受到全球抗感染界的广泛关注，这种在同一遗传背景下同一细菌克隆亚群对某种抗菌药物敏感性各不相同的耐药现象，就是异质性耐药[7]。相关研究已证实[8-9]，异质性耐药是细菌从敏感阶段到耐药阶段进行自然进化的一种中间阶段，若不及时抑制将进展成完全耐药。因此，异质性耐药问题应引起足够的重视和关注。本研究主要是了解目前国内异质性耐药的流行情况和相关临床特征，确证其感染独立危险因素，为临床合理使用抗生素、减缓耐药菌出现、加强院内感染监测和控制提供理论依据和防控措施。

1 材料与方法

1.1 菌株来源

收集2014年1月～2016年12月重庆医科大学附属第一医院（以下简称“我院”）住院患者非重复无菌体液标本（血液、腹腔积液、胸腔积液等）阴沟肠杆菌株138株。亚胺培南异质性耐药阴沟肠杆菌（Imipenem-heteroresistant Enterobacter cloacae，IPM-HR-ECL）菌株作为实验组（115株），非异质性耐药菌株作为对照组（23株），剔除亚胺培南耐藥菌株。从标本来源看，血液49株，胆汁31株，引流液18株等。从科室分布来看，肝胆外科47株，重症监护室17株，骨科17株等。以上所有菌株均经Vitek2 Compact和vitek MS全自动细菌鉴定系统鉴定。

1.2 试剂与仪器

所用药敏纸片（IMP，10 μg/片）、胰蛋白胨、氯化钠、酵母均购自Oxiod公司，抗生素粉末（IMP）购自Sigma公司，MH平板购自重庆庞通医疗器械公司，血平板购自郑州安图生物公司，Vitek2 Compact型全自动细菌分析仪购自法国梅里埃生物公司。

1.3 异质性耐药初筛

K-B药敏试验：采用Mueller-Hinton琼脂（MHA）培养基，调菌悬液浓度为0.5麦氏单位，均匀涂布于培养基表面，采用含有10 μg亚胺培南的药敏纸片进行试验，在35℃下CO2孵箱孵育48 h后测量抑菌圈直径，并按CLSI 2015版本进行药敏结果判读;异质性耐药—抑菌圈内有菌落生长，非异质性耐药—抑菌圈内没有菌落生长。

1.4 异质性耐药现象确证

菌谱分析（PAP）试验：以K-B初筛为呈现异质性耐药的菌株为对象进一步采用PAP（金标准[7]）来确证碳青霉稀异质性耐药表型，并以1株完全敏感株（S）和1株完全耐药菌（FR）作为对照，随机选取5株异质性耐药菌（HR），观察菌株的PAP曲线特点。具体实验方法如下：调节菌悬液麦氏浓度至0.5（约108 CFU/mL）涂抹于含IPM（浓度为0～128 μg/mL）的MH平板上，37℃孵育48 h，计数CFU值N后换算成对数值。以IPM浓度为横坐标，logN为纵坐标绘制半对数图。在高于抗生素耐药折点浓度下有菌落生长，PAP曲线介入完全敏感菌株和完全耐药菌株之间，且细菌在最高非抑菌抗菌药物浓度到最低完全抑菌抗菌药物浓度之间的差异在8倍及其以上，即可判定为异质性耐药菌株。

1.5 危险因素调查

所有病例资料均从检验科LIS系统和电子病历系统收集得到。收集的资料：①一般情况（年龄、性别、是否入住ICU等）;②慢性基础疾病（高血压、慢性肾病、肝病、冠心病等）;③感染前进行侵入性操作情况（肠外营养、内置引流管、导尿管、中心静脉置管、感染前手术史、机械通气等）;④抗生素使用情况（糖肽类、头孢菌素类、碳青霉烯类、喹诺酮类等）。

1.6 统计学方法

应用SPSS 21.0软件进行数据分析。单因素分析中计量资料用均数±标准差（x±s）表示，采用两独立样本t检验，计数资料采用非参数秩和检验。多因素分析采用多元Logistic回归分析，计算危险因素的P值、优势比（OR）、95%CI。以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 临床特征

我院收集的138株阴沟肠杆菌中超过50%的标本来自外科（90/138，65.2%），主要为肝胆外科（47/138，34.1%）、重症医学科（17/138，12.3%）和骨科（17/138，12.3%）等三个科室。从标本分布来看，这些菌株主要来源于血液（49/138，35.5%），胆汁（31/138，22.5%），引流液（18/138，13.0%），胸腔积液（9/138，6.5%）等无菌体液标本。从异质性耐药初筛结果来看，这些菌株中有115株（115/138，83.3%）对亚胺培南具有异质性耐药现象。从异质性耐药发生率来看，IPM-HR-ECL从2014年的78.9%（30/38）到2015年的83.0%（39/47），再增长到2016年的86.8%（46/53），呈明显增长趋势。

2.2 异质性耐药表型初筛

K-B药敏纸片法结果显示，亚胺培南纸片抑菌环内出现了许多菌落（透射光下肉眼可见），可初步认为这些菌落在抗生素压力下具有潜在耐药性，为异质性耐药菌落。见图1。

2.3 PAP验证

IPM-HR-ECL的PAP曲线如图2所示：101号敏感对照在最低抑菌浓度前后的培养中，PAP曲线突然下降至水平，21、45、66、71、98号（IPM-HR实验株）的PAP曲线逐渐缓慢下降，即随着IPM浓度的增加，菌株在平板生长的菌落数逐渐减少;88号（FR对照株）先在一定IPM浓度范围内基本保持水平，到达最低抑菌浓度后，曲线也是突然下降至0，基本不再有菌落生长。

2.4 IPM-HR-ECL感染的单因素分析

单因素分析结果显示：男性、导尿管、中心静脉置管以及碳青霉烯类抗生素使用是IPM-HR-ECL感染的主要危险因素（P < 0.05）。见表1。

2.5 IPM-HR-ECL感染的多因素分析

多因素分析结果显示：男性（OR = 3.40，95%CI：1.16～9.92）、导尿管（OR = 3.74，95%CI：1.25～11.24）、中心静脉置管（OR = 3.65，95%CI：1.22～10.89）以及碳青霉烯类抗生素使用（OR = 6.79，95%CI：1.48～31.14）是引起IPM-HR-ECL相关感染的独立危险因素（P < 0.05）。见表2。

3 讨论

阴沟肠杆菌作为院内感染常见的条件病原菌之一，在机体抵抗力下降时可引起各种医院感染。异质性耐药被认为是细菌进展至完全耐药的中间阶段[10]。由于临床药敏试验往往不能检出耐药亚群，给临床用药带来了困难。目前国外阴沟肠杆菌异质性耐药的研究仅有1例[11]。国内还未报道过阴沟肠杆菌对亚胺培南异质性耐药现象。

我院收集的138株亚胺培南异质性耐药的阴沟肠杆菌，超过50%的标本来自外科，说明外科手术及侵入性操作可能增感染风险。所有菌株对亚胺培南的异质性耐药率为83.3%，耐药形式较为严峻。另外异质性耐药率呈明显增长趋势，这可能与细菌长期暴露在抗生素压力下，敏感菌株向耐药菌株诱导分化有关[12-13]。

男性、導尿管、中心静脉置管和碳青霉烯类抗生素使用是IPM-HR-ECL感染的主要危险因素。其中中心静脉置管和导尿管是IPM-HR-ECL感染的独立危险因素，这与国内外报道基本一致[14-15]。中心静脉置管及导尿管容易附着多种条件致病菌，形成生物膜，增加感染率[16-17]。加上患者在长期使用多种抗生素作用下，更加容易感染异质性耐药菌株。此外，男性也是IPM-HR-ECL感染的独立危险因素，在本研究中超过80%的男性患者有过手术史和侵入性操作，其感染原因可能是手术过程中会改变患者功能状态，破坏机械屏障，患者自身免疫功能降低，术后患者置管，均能造成患者感染率增大[18-19]。因此，临床工作者应重视无菌操作，尽早拔除引流管，合理使用抗生素，加强侵入性操作留置管的护理，防止感染发生。

碳青霉烯抗生素使用是IPM-HR-ECL感染的独立危险因素。细菌在抗生素的选择压力下，敏感菌被抑制或杀灭，耐药菌大量繁殖成为优势菌[20-21]。因此临床医生应结合药敏实验合理用药和联合用药，避免经验性用药，尤其是滥用碳青霉烯类抗生素，以减少异质性耐药菌株的产生。

综上所述，由于异质性耐药的特殊性，临床医生应严格把握抗菌药物的适应证，合理用药和联合用药，同时加强对阴沟肠杆菌的监控。其次，减少不必要的侵入性操作和肠外营养，对提高临床治愈率及预防阴沟肠杆菌异质性耐药菌株的产生和传播具有重要意义。

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（收稿日期：2019-01-03  本文編辑：李亚聪）