外周血中Th17/Treg与慢性乙型肝炎患者乙肝病毒DNA载量的相关性

张辉, 张赓

天津市宝坻区人民医院感染科(天津 301800)

临床上将乙型肝炎(乙肝)病毒检测为阳性，且病程超过6个月或虽然发病日期不明确而临床上有慢性肝炎表现的患者称为慢性乙肝，主要由乙型肝炎病毒(HBV)感染引起，在我国属于乙类传染病，主要通过母婴、血液制品、皮肤黏膜和性接触传播。不同宿主、环境因素均可导致乙肝病毒感染患者出现不同的结局和临床类型，如不能及时控制，则会发展为慢性乙肝，在全球范围内均较常见[1-3]，尤其是我国。长期的慢性乙肝可逐渐发展至肝硬化，甚至肝癌[4-6]。免疫机制在乙肝病毒感染患者病程迁延中发挥了重要作用，既往研究主要集中在Th1/Th2免疫平衡上，但逐渐有学者发现部分免疫现象不能使用Th1/Th2免疫平衡解释，所以越来越多的学者开始重视Th17/Treg免疫平衡，研究显示Th17/Treg在慢性乙肝患者中存在平衡失调，与慢性乙肝患者病情相关[7-9]。但Th17/Treg与慢性乙肝患者乙肝病毒DNA载量的相关性尚不清楚，为此我们设计了本研究。

1 资料与方法

1.1 一般资料 2016年11月至2018年11月，前瞻性收集我院收治的慢性乙肝患者100例，纳入标准：(1)慢性乙肝；(2)在我院接受诊治，可以获得检测标本；(3)年龄18～65岁；(4)同意参与本研究。排除标准：(1)合并其他类型肝炎；(2)肝癌或肝脏其他重大病变；(3)其他类型感染；(4)恶性肿瘤；(6)心脑肺功能不全；(6)肾功能不全；(7)溃疡性结肠炎等免疫系统疾病；(8)不能配合完成本研究。研究期间根据纳入标准和排除标准，共纳入慢性乙肝患者100例作为观察组，同期收集100例至我院健康体检的成人作为对照组；收集100例至我院诊治的乙肝病毒携带者(乙肝表面抗原阳性，但未发病，无慢性肝炎症状)作为携带组；携带组和对照组均无上述相关疾病。3组年龄、性别、体质指数差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 3组一般资料比较

表1 3组一般资料比较

项目例数年龄(岁)男性[(例)%]体质指数(kg/m2)观察组10046.01±10.1865(65.00)25.00±2.74携带组10046.65±9.9260(60.00)25.43±3.02对照组10047.45±9.8562(62.00)25.33±2.53F/2值0.8730.1941.016P值0.3840.6590.311

1.2 观察指标 (1)外周血中Th17、Treg细胞；(2)外周血中白细胞介素(IL)-17、IL-10；(3)乙肝病毒DNA载量；(4)肝脏病变纤维化程度。

1.3 检测方法 (1)入院后完善健康知识宣教和知情同意书签署，于24 h内，取患者空腹血5 mL，利用美国Baekman公司提供的流式细胞仪测定样本中Th17、Treg表达水平，淋巴细胞亚群荧光直标单颗粒抗体试剂购自美国Backman公司，该项目检测由上海裕隆医学检验所股份有限公司完成。(2)外周血中IL-17、IL-10：于入院24 h内，取患者空腹血5 mL，使用离心机(3 000 r/min)离心10 min后，取上层血清，使用ELISA法检测血清中IL-17、IL-10表达水平，相关试剂盒由上海裕隆医学检验所股份有限公司提供。(3)乙肝病毒DNA载量：使用荧光定量PCR法检测慢性乙肝患者血清中(血清获取方式同上)乙肝病毒DNA载量。(4)肝脏病变纤维化程度：行肝活组织检查，对样本进行HE染色、Masson染色，评估慢性乙肝患者肝脏纤维化程度分级(S分级，S0～S1为轻度纤维化，S2～S4为重度纤维化)。

2 结果

2.1 3组外周血中Th17、Treg细胞水平比较 与对照组或携带组比较，观察组患者Th17、Treg细胞水平增高。见表2。

表2 3组外周血中Th17、Treg细胞水平比较

表2 3组外周血中Th17、Treg细胞水平比较

项目例数Th17Treg观察组1003.07±1.319.80±2.58携带组1002.65±1.33∗8.12±2.12∗对照组1001.95±0.85∗△7.70±2.75∗△F值7.1965.577P值0.0000.000

*与观察组比较P<0.05；△与携带组比较P<0.05

2.2 3组外周血IL-17、IL-10水平比较 与对照组或携带组比较，观察组患者IL-17、IL-10水平增高。见表3。

2.3 慢性乙肝患者病毒学参数 100例慢性乙肝患者乙肝病毒DNA载量为(6.42±1.76)×104IU/mL。乙肝表面抗原阳性者100例，乙肝e抗原阳性者62例，乙肝表面抗体阳性71例，e抗体阳性者58例，核心抗体阳性者100例。慢性乙肝患者肝脏为轻度纤维化的56例，重度纤维化的44例。

表3 3组外周血IL-17、IL-10水平比较

表3 3组外周血IL-17、IL-10水平比较

项目例数IL-17IL-10观察组10034.17±8.9229.76±7.05携带组10028.78±7.76∗26.38±6.12∗对照组10023.30±8.19∗△23.65±5.48∗△F值8.9716.845P值0.0000.000

*与观察组比较P<0.05；△与携带组比较P<0.05

2.4 慢性乙肝患者肝纤维化程度与Th17、Treg、IL-17、IL-10的相关性 与肝脏轻度纤维化的患者相比，重度纤维化患者Th17、Treg、IL-17、IL-10均显著升高(P<0.05)。见表4。

2.5 慢性乙肝患者Th17/Treg与乙肝病毒DNA载量的相关性 慢性乙肝患者乙肝病毒DNA载量与Th17、Treg、IL-17和IL-10均呈显著正相关(P<0.05)。见表5和图1。

表4 慢性乙肝患者肝纤维化程度与Th17、Treg、IL-17、IL-10的相关性

表4 慢性乙肝患者肝纤维化程度与Th17、Treg、IL-17、IL-10的相关性

项目例数Th17(%)Treg(%)IL-17(pg/mL)IL-10(pg/mL)轻度纤维化562.12±0.547.56±1.2526.25±2.0924.07±2.32重度纤维化443.32±0.588.83±1.1832.00±1.9229.32±2.71t值10.6775.16814.15010.430P值0.0000.0000.0000.000

3 讨论

慢性乙肝如果不能得到及时控制，可逐渐发展至肝硬化和肝癌，是我国肝癌最主要的诱发因素。免疫功能在慢性乙肝患者中的作用逐渐被重视，本研究探讨了Th17/Treg与慢性乙肝患者乙肝病毒DNA载量的相关性，结果显示Th17/Treg及其细胞因子(IL-17和IL-10)在慢性乙肝患者中均升高，且与患者乙肝病毒DNA载量呈显著正相关，可能参与了肝脏纤维化的发展过程。

表5 慢性乙肝患者Th17/Treg与乙肝病毒DNA载量的相关性

A:Th17;B:Treg;C:IL-17;D:IL-10

乙型病毒性肝炎是由于感染乙肝病毒引起，是一种双链、环形、不完全闭合的DNA病毒，核蛋白(HBcAg)是其核心部分，外层则是病毒的外膜，因此乙型病毒性肝炎抵抗力较强，在外界可以存活，甚至可以耐受一般浓度的消毒剂，即使在60℃高温中还可以耐受4 h，煮沸10 min、高压蒸汽消毒2 min方可灭活，因此具有较强的传染性，福建省的一项流行病学调查显示乙肝病毒的发病率高达172.94/10万[10]。乙肝病毒DNA载量是判断乙肝病毒有无复制的“金指标”，可以用来评估人体内存在乙肝病毒的多少和活跃性，乙肝病毒DNA载量越高，说明传染性越强，如果乙肝病毒DNA载量大于1 000或者1.0e+ 003拷贝/mL，说明乙肝病毒DNA呈阳性，提示HBV复制和有传染性，是乙肝治疗过程中监测疗效的重要手段[11-14]。本研究显示Th17/Treg及其细胞因子(IL-17和IL-10)在慢性乙肝患者中均升高，且与患者乙肝病毒DNA载量呈显著正相关，提示慢性乙肝患者病毒活跃性越强，Th17/Treg及其细胞因子(IL-17和IL-10)越高，最终导致肝脏纤维化。Th17是一种促炎细胞，主要通过产生IL-17发挥其生理作用，是抗感染免疫中的效应性T细胞，当乙肝病毒活跃时，机体代偿性地提高Th17、IL-17，以杀灭乙肝病毒[15-17]。Th17、IL-17增高，可以促进血管源性细胞因子的表达，促进肿瘤微血管生成，促进肿瘤生成、转移和浸润。但是慢性乙肝患者病毒活跃时，肝细胞炎性反应加重，导致肝功能损伤，为调控免疫应答对肝细胞的损伤，机体会代偿性地增加免疫调控作用。IL-17的增加，还可以诱导IL-6的产生，激活STST3信号通路，促进肝脏纤维化的发展过程。Treg和IL-10是一种免疫抑制细胞和因子，其水平升高是慢性乙肝患者的一种自我保护作用，抑制肝组织中炎症反应，从而达到减轻肝细胞损伤的作用[17-21]。Treg由Sakaguchi于1995年报道，目前已经成为肿瘤治疗的重要靶点，在肿瘤患者中，具有免疫抑制和免疫无功能作用，可以帮助肝癌细胞发生免疫逃脱，加速肝癌细胞的生长和转移[22-24]。异常增高的Treg细胞，还可以破坏CD8+T细胞对肿瘤细胞的杀伤作用，破坏其他免疫杀伤机制，导致肝癌细胞的快速生长和转移。目前已有研究证实了Th17/Treg平衡失调与慢性乙肝患者肝功能损伤、肝纤维化有关[25-26]。支持本研究，本研究显示与肝脏轻度纤维化的患者相比，重度纤维化的患者Th17/Treg平衡失调更严重，但本研究进一步探讨了Th17/Treg平衡失调与乙肝病毒DNA载量的相关性，发现慢性乙肝患者乙肝病毒DNA载量与Th17、Treg、IL-17和IL-10均呈显著正相关(P<0.05)。说明Th17/Treg平衡失调可能可以促进乙肝病毒在体内的复制，进而加重肝功能损伤。调节Th17/Treg平衡功能，可能有利于减轻慢性乙肝患者肝纤维化发展进程，但目前相关研究尚缺乏，需要进一步深入研究。

本研究的主要不足为未能对乙肝病毒在体内的复制与Th17/Treg平衡功能的相关性进行更深入的探讨，且病例数仅为100例，相对不足。

综上所述，外周血中Th17、Treg、IL-17和IL-10在慢性乙肝患者中均升高，与乙肝病毒DNA载量呈显著正相关，可能参与了肝脏纤维化的发展过程。