香港牡蛎野生群体家系建立及耐高盐性筛选

张兴志 官俊良 等

摘要：【目的】選育出香港牡蛎（Crassostrea hongkongensis）耐高盐品系，为提高其养殖经济效益和促进产业持续发展提供保障。【方法】以广西茅尾海海区野生香港牡蛎为亲本，采用♂∶♀=1∶3的交配方式建立30个香港牡蛎野生群体全同胞家系，比较各家系早期的生长性状差异，并对30个家系在高盐度（25‰～30‰）自然海域的生长和存活率进行监测，对香港牡蛎耐高盐性进行筛选。【结果】各家系间的受精率及孵化率无显著差异（P>0.05，下同）。在幼虫培育过程中，至15日龄时以家系G1的壳高最大，家系I1的壳高最小，二者差异显著（P<0.05）;以G为父本的半同胞家系存活率较低，均低于平均值（63.21%）;而以D为父本的3个家系存活率较高，均超过71.33%。海区养殖期间，至60日龄时各家系均表现出较高的存活率，保持在90.00%以上;至120日龄时，除家系B1、B2、B3、E1、I1、J1、J2和J3外，其他各家系的存活率均为0;至300日龄时家系B1、B2、B3、I1、J1和J2的存活率在40.23%～60.32%。不同家系的壳高在相同日龄差异明显，养成期至300日龄时，家系B2的壳高最大，但与家系B1和J3的差异不显著;以家系E1的壳高最小。【结论】通过家系建立结合高盐海域养殖的方式筛选获得B1、B2、I1、J1和J2等优良家系，可为香港牡蛎耐高盐品系选育提供种质资源。

关键词： 香港牡蛎;家系选育;耐高盐;壳高;存活率

中图分类号： S968.311                     文献标志码： A 文章编号：2095-1191（2019）02-0385-06

Abstract：【Objective】High-salt-tolerance strains of Crassostrea hongkongensis were bred to provide support for improving its breeding economic benefits and promoting industrial sustainable development. 【Method】Wild C. hongkongensis in Maowei Sea， Guangxi was used as parent. Thirty full-sib families of wild population of C. hongkongensis were established using artificial insemination（♂∶♀=1∶3）. The differences of phenotype characters in early growth stage were compared. The growth and survival rates of the families in the natural sea with high salinity（25‰-30‰） were monitored， and the high-salinity tolerance of the oysters were screened. 【Result】The results showed that there was no significant difference in fertilization rate and hatching rate among families（P>0.05， the same below）. In the larval stage， shell height of G1 grew the highest on 15 day-age， and that of the I1 was the shortest， the difference between them was significant（P<0.05）. The survival rates of the three families with G as the male parent were low， which were lower than the average（63.21%）. The three families with D as the male parent had high survival rate， all of which exceeded 71.33%. During the sea culture period， at 60 days of age， the survival rate of each family was high， all of which were over 90.00%. At 120 days of age， except for B1， B2， B3， E1， I1， J1， J2， and J3， the survival rate of each family was zero. Families B1，B2，B3，I1，J1 and J2 were found with a survival rate of 40.23%-60.32% at the age of 300 days. With the highest shell height，the shell height of  B2 was not significantly different from that of B1 and J3. The shell height of E1 was the shortest. 【Conclusion】In this experiment， a group of outstanding families， such as B1， B2， I1， J1 and J2， are obtained through family establishment and high salinity sea culture. It provides germslasms for C. hongkongensis breeding and selection with high salinity tolerance.

Key words： Crassostrea hongkongensis; family selection; high salinity resistance; shell height; survival rate

0 引言

【研究意义】香港牡蛎（Crassostrea hongkongensis）原称近江牡蛎，是广西著名的原产地理标志产品。香港牡蛎高蛋白、低脂肪，且富含多种维生素及微量元素，其中钙含量接近牛奶，素有“海洋牛奶”之称。广西牡蛎养殖历史悠久，养殖面积逐年扩大，是我国牡蛎的主要产区之一（周昌仕等，2016）。广西钦州湾茅尾海是我国最大的香港牡蛎天然采苗区（王如才，2004）。当前香港牡蛎养殖主要采用未经选育的天然苗种（钟方杰等，2013），但春季牡蛎大规模死亡现象频发（於锋，2016），给养殖户带来巨大经济损失。经调查发现，香港牡蛎大规模死亡主要发生在盐度较高的海域，且盐度越高死亡率越高、死亡期来临越早。因此，加强香港牡蛎耐盐性选育对促进其养殖产业健康发展具有重要意义。【前人研究进展】选择育种是培育新品种的有效手段，而家系建立及系统选择是选择育种的重要方法（吴仲庆，2000），即首先建立具有优良性状的家系，再通过多代选择以提高目的性状的基因频率，最终获得具有更高经济价值的新品种（楼允东，2009）。至今，国内外学者针对主要经济牡蛎如美洲牡蛎（C. virginica）（Oliver et al.，2000）、欧洲牡蛎（Ostrea edulis）（Lynch et al.，2014）、长牡蛎（C. gigas）（Langdon et al.，2003;Evans et al.，2004;Dégremont et al.，2005;葛建龙等，2016）等家系的选育已取得一些成果，并成功培育出长牡蛎海大1号、长牡蛎海大2号及福建牡蛎金蛎1号等优良新品种（孟乾等，2018;巫旗生等，2018）。这些新品种的获得能有效提高牡蛎生长速度和养殖效益，实现产量、质量和效益协调发展，对增加渔民收入及繁荣区域经济具有重要意义。【本研究切入点】目前，仅陈子桂等（2011）成功建立了9个半同胞香港牡蛎家系，并对各家系的受精、孵化、成活率及早期生长发育进行评价;而有关香港牡蛎家系选育及耐盐性筛选的研究鲜见报道。【拟解决的关键问题】自2015年起开始开展香港牡蛎野生群体的收集及耐盐性选育，通过构建广西茅尾海香港牡蛎野生群体家系，以壳高生长及存活率等性状对家系的耐盐性进行评价，旨在选育出香港牡蛎耐高盐品系，为提高其养殖经济效益和促进产业持续发展提供保障。

1 材料与方法

1. 1 亲贝来源

供试用亲贝为广西茅尾海海区野生香港牡蛎，于2016年3月在广西茅尾海非牡蛎养殖区潜水至海底采集。吊养于蚝排促熟，待性腺成熟时随机挑选壳型规整、活力强的个体作为试验材料。

1. 2 家系建立

在水温28 ℃、盐度21‰、pH 7.8～8.0的条件下，采用解剖取卵的方式获取精卵。交配方式采用1♂∶3♀（表1），即1个父本与3个母本分别交配。共建立10个父系半同胞家系（A～J）和30个母系全同胞家系（A1、A2、A3……J1、J2、J3）。待受精卵发育30 min（囊胚期）后，用500目筛绢网洗卵，然后将各试验组受精卵转移至100 L塑料桶中孵化和培育。每试验组设3个重复。

1. 3 子代培育

幼虫期间用沙滤海水（水温28～29 ℃，盐度20‰～22‰，pH 7.8～8.0）进行培育，调整幼虫密度为3～4个/mL。每隔2 d全部换水，为避免不同家系间混杂，每个家系换水后淡水冲洗并浸泡筛绢网。每天投喂2次饵料，6日龄以前投喂云微藻（Chlorella sp.），之后混合投喂云微藻与角毛藻（Chaetoceros muelleri），投饵量视幼虫摄食情况而定。每次换水时调整幼虫密度，使各家系密度保持一致。待幼虫出现眼点及足时，投放牡蛎壳串采苗。

1. 4 家系耐盐性筛选

当家系稚贝发育至30日龄、壳高达1.00～2.00 mm时，将各家系稚贝吊养于生态池内进行中间培育及养成。生态池约66.67 ha，涨退潮可正常纳水排水。周边无河口等淡水注入，盐度相对稳定，周年维持在25‰～30‰。

1. 5 數据测量与统计分析

幼虫期（壳高<350 μm）在显微镜下测量壳高。稚贝及养成期（壳高>2.0 mm）用游标卡尺测量壳高，精确度0.02 mm。每个重复随机测量30个个体。于6、12、60、90、120、200和300日龄分别测定幼虫或贝苗存活率。采用SPSS 19.0对试验数据进行单因素方差分析（One-way ANOVA），以Duncan’s新复极差法进行多重比较，并用Excel 2016制图。

2 结果与分析

2. 1 各家系的受精率和孵化率

各家系的受精率及孵化率详见表2。各家系均表现出较高的受精率及孵化率，受精卵最高的家系为F3[（99.66±0.36）%]，最低的家系为C1[（94.98±3.26）%]，但家系间差异不显著（P<0.05，下同）;孵化率最高的家系为A3[（85.75±4.45）%]，最低为G3[（79.88±6.36）%]，各家系间也无显著差异。

2. 2 各家系早期生长及存活率比较

在幼虫培育过程中，6日龄时以家系J1的壳高最大，显著高于其他家系（P<0.05，下同）;家系A2的壳高最小，仅与家系A3、I3和J3差异不显著。9日龄时仍以家系J1的壳高最大，与家系G3和H1差异不显著;家系I1的壳高最小，显著低于除家系I3和J2外的其他家系。12日龄时以家系B1的壳高最大，与其他家系均达显著差异水平;家系I1的壳高最小，显著低于其他家系。至15日龄时，家系G2的壳高最大，与家系B1、C2和G1差异不显著;仍以家系I1的壳高最小，也显著低于其他家系（图1）。

由图2可看出，6日龄时以家系B2的存活率最高，与家系E1差异不显著;家系G2的存活率最低，仅与家系F2差异不显著。至12日龄时，以家系D2的存活率最高，与家系A3和E1差异不显著。浮游幼虫期间，以G为父本的半同胞家系存活率较低，均低于平均值（63.21%）;而以D为父本的3个家系存活率较高，均超过71.33%。

2. 3 各家系自然海区养殖生长及存活率比较

2016年8月—2017年7月自然海区养殖的盐度变化如图3所示，周年盐度波动不明显，最低值出现在夏季雨季（2017年6—7月），最高值出现在2017年1月，整年盐度范围在25‰～29‰。不同家系的存活率如图4所示。至60日龄时，各家系均表现出较高的存活率，保持在90.00%以上;90日龄时以家系B1、B2、B3、I1、J1、J2和J3的存活率较高（50.88%～71.25%），与其他家系差异显著;至120日龄时，除家系B1、B2、B3、E1、I1、J1、J2和J3外，其他家系的存活率均为0;至300日龄时，B1、B2、B3、I1、J1和J2等家系的存活率在40.23%～60.32%，其中又以家系B1的存活率最高（60.32%）。

不同家系的壳高在相同日龄差异明显（图5和图6）。30日龄时以家系G1的壳高最大，平均壳高为4.98 mm，与家系B1、C2、C3、F1和F2的差异不显著，与其他家系差异显著。至60日龄时，家系I1的壳高最大，平均为24.30 mm，与其他家系间存在显著差异;除家系I1外，家系A2、B1、D3、E2、E3、F1、F2、G1和G3等的壳高均超过平均值（16.05 mm），且各家系间差异不显著。养成期至300日龄时，家系B2的壳高最大，但与家系B1和J3差异不显著;以家系E1的壳高最小。

3 讨论

香港牡蛎主要分布在我国福建厦门以南（张素萍，2008），生活于低盐度河口区。盐度是影响香港牡蛎生长、代谢及胚胎发育的重要环境因素。林丽华等（2012）研究发现，盐度对香港牡蛎滤水率、摄食率、耗氧率和排氨率的影响极显著。时少坤等（2013）研究表明，盐度骤变对香港牡蛎的免疫活力具有明显的刺激作用，且在一定范围内能增强机体免疫力，香港牡蛎对低盐有很强的适应能力，但在高盐胁迫下其免疫活力下降。Huo等（2014）通过研究盐度对香港牡蛎胚胎发育、生存和生长的影响，结果发现高盐条件下（30‰）受精卵孵化率明显低于中盐（23‰）和低盐（15‰）组，在幼虫和稚贝期，低盐组香港牡蛎的生长速度和存活率均显著高于中盐和高盐组。官俊良（2015）通过分析盐度对两个香港牡蛎群体受精、孵化及生长、存活的影响，证实香港牡蛎幼贝对高盐度具有很强的适应能力。盐度可通过调控代谢强度、激素水平等影响水生生物的性腺发育（Kripa et al.，2009;Long et al.，2017;Mandal et al.，2017），说明在春季里高盐度可能是通过影响香港牡蛎性腺的发育过程而导致其出现大规模死亡。

贝类繁殖能力强，世代间隔短，野生群体遗传变异水平高，特别适合开展选择育种工作（张国范和刘晓，2006）。选择育种需要大量家系或群体以筛选出优良性状，但牡蛎为固着型贝类，需固着器采苗，在牡蛎育种实践中维系大规模群系及养成设施的费用极高。因此，若能在稚贝阶段对培育群系进行目标性状筛查，将极大降低后期养成与管理成本。为检验香港牡蛎的耐盐性，并获得耐盐群体，本研究通过家系建立结合高盐海域养殖的方式，比较各家系不同时期生长状况及存活率的差异，发现在盐度25‰～30‰时提前筛选获得的B1、B2、I1、J1和J2等家系，实现了香港牡蛎耐盐型家系第一代筛选。可见，在香港牡蛎稚贝阶段对家系耐高盐性进行筛选具有较高的可行性。

目前，有关香港牡蛎人工选育的研究报道较少。陈子桂等（2011）建立了9个近江牡蛎半同胞家系，并比较其受精率、孵化率、存活率及早期生长情况。喻子牛等（2017）进行牡蛎种间杂交（香港牡蛎♀×长牡蛎♂），筛选出生长快、盐度适应范围略高于香港牡蛎的杂交新品种华南1号。存活率是影响牡蛎产量的重要性状，Dégremont等（2010）研究表明，在夏季通过选择育种的方式可有效提高长牡蛎存活率，且存活率的选育不会影响其生长性状。本研究同时将生长和存活率作为选育指标，进行野生群体香港牡蛎耐高盐性状的家系选育，结果发现广西茅尾海野生群體家系间对高盐度的耐受性差异显著，说明香港牡蛎耐盐性状受遗传因素的影响较明显。此外，部分家系在幼虫期生长速度较快，但经高盐海区养殖后存活率很低，甚至全部死亡，说明生长与存活率两个性状间不存在相关性。

4 结论

通过家系建立结合高盐海域养殖的方式筛选获得B1、B2、I1、J1和J2等优良家系，可为香港牡蛎耐高盐品系选育提供种质资源。

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（責任编辑 兰宗宝）