基于尿液代谢组学探究刺血结合药线点灸对急性痛风性关节炎大鼠作用机制研究

陈日兰 何彦霖 江海燕 刘泓毅 韦秋娜 罗国馨 彭元霞 朱英

〔摘要〕 目的 通过观察刺血结合药线点灸对急性痛风性关节炎模型大鼠尿液代谢组学影响，初步探讨刺血结合药线点灸对急性痛风性关节炎作用机制。方法 将39只SD大鼠随机分3组：空白组、模型组、治疗组，每组13只。模型组仅造模，治疗组造模后给予刺血结合药线点灸治疗。记录各组大鼠的步态、关节肿胀度变化;并运用气相色谱仪与飞行时间质谱仪的联用代谢组学技术分析大鼠尿液代谢产物，进行主成分分析和偏最小二乘方判别分析对数据进行统计。结果 治疗后3组大鼠的步态评价和造模后各时间段的关节肿胀度比较，差异均有统计学意义（P<0.05）;以VIP>1为标准寻找治疗组与模型组中的标志性差异性代谢物16个，以P<0.05及质谱信息再鉴别出标志性差异代谢物α-酮戊二酸、γ-氨基丁酸1、肌醇、半乳糖苷、柠檬酸5个;经MetPA数据库进行二次分析，发现急性痛风性关节炎模型大鼠治疗前后其尿液代谢组学变化涉及代谢通路13条，其中丁酸代谢、三羧酸循环、半乳糖代谢以及丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢这4条代谢途径影响值的临界点>0.10。结论 刺血结合药线点灸可以改善急性痛风性关节炎大鼠步态及关节肿胀度。其作用机制可能是通过影响体内丁酸代谢、三羧酸循环、半乳糖代谢以及丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢通路从而抑制炎症因子转录生成，加速局部代谢循环，起到消炎、镇痛作用。

〔关键词〕 痛风性关节炎;刺血;药线点灸;代谢组学

〔中图分类号〕R245.31       〔文献标志码〕A       〔文章编号〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2019.02.020

痛风性关节炎是因尿酸钠沉积于关节导致关节红肿、疼痛的关节疾病[1]。严重影响患者生活，且近年来患病率明显升高并有年轻化趋势[2]。刺血结合药线点灸疗法以其简便、快捷、显效在痛风性关节炎治疗中凸显优势，但是其机制的研究甚少，尤其在动物实验方面，因此，加强实验研究为临床应用提供理论依据，迫在眉睫[3-6]。代谢组学能从整体水平研究生物体内源性小分子在内外环境或基因影响下的代谢物变化，可对比评价治疗前后的机体病理生理状态，解释生物体代谢的本质科学寻找有效的治疗措施，降低治疗的毒副作用，提高临床疗效[7]。基于此，本研究使用代谢组学技术，通过检测、分析急性痛风性模型大鼠尿液中代谢产物，寻找差异性标志物，分析相关代谢通路，以探究刺血结合壮医药药线点灸治疗急性痛风性关节炎的机制。

1 材料与方法

1.1  实验动物与分组

雄性SD大鼠39只，健康成年，体质量（200±20） g，购自广西医科大学动物实验中心[动物许可证号：SCXK（桂）2016-0002]，根据动物伦理学于广西中医药大学实验室动物房适应性喂养10周后，按体质量分级随机分为空白组、模型组、治疗组，每组13只。

1.2  主要实验试剂与仪器

MODELDS-671电子天平（大连星海电子衡器有限公司）;TG16-WS 台式高速离心机（湘仪离心机仪器有限公司）;L-2-氯苯丙氨酸（CAS号：103616-89-3，质量分数≥98%），购买于上海恒柏生物科技有限公司;双（三甲基硅烷基）三氟乙酰胺（BSTFA）[含1%三甲基氯硅烷（TMCS），v/v]，购买自美国REGIST科技公司;Agilent 7890A气相色谱仪（美国安捷伦科技公司）;Pegasus HT气相气相色谱-飞行时间质谱仪（美国LECO公司）;壮医药药线（直径0.7 mm，长30 cm，购买自广西壮族自治区壮医医院）。

1.3  尿酸钠溶液制备

电子秤取1.000g微晶尿酸钠结晶，玻璃杯碾碎后放入烧杯，加9 mL生理盐水，再加1 mL吐温80，加热搅拌，配制成10 mL尿酸钠溶液[8]。

1.4  模型制备

采用Coderre等[8]的改良法对模型组、治疗组大鼠进行造模。使用4号注射针头的注射器将0.4 mL尿酸钠溶液注入到大鼠的右侧踝关节腔内。注射部位及方法[9]：在操作台上固定大鼠，充分暴露右后侧踝关节，并将其摆放成直角后找到右后肢背侧正中胫腓骨与踝关节之间的间隙，将注射器针头倾斜45°通过此间隙插入关节腔内，将尿酸钠混悬液注射进关节腔，以对侧关节囊突出为标准。

1.5  造模成功判定[8，10]

1.5.1  大鼠行為  造模前大鼠精神良好，毛色白，饮食饮水正常、体质量正常增加，关节炎的发生率为百分之百。造模后，精神欠佳，毛色发黄干枯，踝关节在炎症高峰期可触到痛风结节，行动可见跛行，饮食量和饮水次数均明显减少，体质量增长减缓明显。

1.5.2  右后肢踝关节形态学改变  注射尿酸钠溶液24 h后，每组随机抽取3只大鼠进行HE染色。病理切片图片可以看出：在光镜下，造模后的大鼠踝关节软组织周围的毛细血管扩张、充血，关节滑膜增厚并伴有大量以中性粒细胞为主的炎性细胞浸润，局部软组织遭到破坏，新生小血管上有较多的成骨纤维细胞形成，肉芽组织中出现较多的异物多核巨细胞。而正常的大鼠踝关节在光镜下是结构清晰、无病理性改变的，所以通过肉眼观察和HE染色光镜观察，均提示造模成功[11]。

1.6  干预方法

空白组、模型组不做任何治疗性干预;治疗组：在肿胀的踝关节局部取老鼠造模一侧踝关节上红肿最明显的地方作为阿是穴，常规消毒后，用5号一次性注射器针头在该处点刺放血，放血量使用注射器吸取以精确出血量达（0.30±0.04） mL。造模12 h后每天放血1次，连续3 d。药线点灸：刺血结束后在肿胀踝关节局部沿肿胀外围向中心点灸，3壮，每壮相隔2 mm。连续3 d。

1.7  步态观察和关节肿胀度分析

1.7.1  步态观察  参照步态分级标准表（见表1）[12]，对空白组、模型组、治疗组进行步态观察，并记录。

1.7.2  关节肿胀度观察  分别于造模前、造模后12、24、48、72 h用皮尺测量踝关节肿胀度（关节肿胀度=造模后关节周径-造模前的关节周径），取2次测量所得数值的平均值，比较各组大鼠造模前后踝关节肿胀变化程度[6]。

1.8  尿液代谢组学检测

1.8.1  样本收集  收集24 h尿液，以8 000 r/min离心10 min，用2 mL冻存管收集上层尿液，收集完成以后及时密封置于-80 ℃的液氮罐保存，送检。

1.8.2  样本处理  （1）代谢物萃取：取100 μL尿液样本，加入20 μL尿素酶（80 mg/mL），振荡混匀30 s，37 °C烘箱孵育1 h;加入0.35 mL甲醇，再加入20 μL L-2-氯苯丙氨酸，漩涡混匀30 s;将上述二者混匀后，在4 ℃，13 000 r/min的环境下离心15 min;缓慢取出0.39 mL上清液放入2 mL进样瓶（甲烷硅基化的）中，供检验。（2）代谢物衍生化：将提取的代谢物放入真空浓缩器中进行干燥并提取;在干燥后的代谢物中加入80 μL甲氧胺盐试剂（甲氧胺盐酸盐，溶于吡啶20 mg/mL），轻轻混匀后，放入烘箱中80 ℃孵30 min;向每个样品中迅速加入100 μL BSTFA（含有1% TCMS，v/v）后70 ℃孵育120 min;冷却至室温，向混匀的样本中加入10 μL FAMEs（饱和脂肪酸甲酯标准混合液，溶于三氯甲烷C8-C16：1 mg/mL;C18-C24：0.5 mg/mL）;混匀，上机检测。（3）质谱条件：选择不分流模式下的进样量1 μL，初始的柱温为60 °C保持1 min后开始以升温速度为每分钟10 ℃的速率上升至330 ℃，持续10 min;前进口样的温度保持在280 °C，传输药线温度在280 °C，离子源温度220 °C;电离电压：-70eV;载气使用氦气，前进样口吹扫流速为3 mL/min，柱流速为1 mL/min;扫描方式为全扫描85～600 m/z，频率保持为20 spec/s。溶剂延迟时间366 s。

1.9  数据处理及生物标志物筛选

等级资料采用？字2检验;计量结果以“x±s”表示，数据采用SPSS 22.0软件。采用方差分析，多重两两比较采用LSD或SNK检验，方差不齐者采用 Dunnet T3法检验，以P<0.05为差异有统计学意义。代谢组学采用LECO公司的Chroma TOF4.3X软件和LECO-FiehnRtx5数据库对尿液质谱图信息进行峰匹配，峰提取及数据导出等处理。将上述得到的数据导入SIMCA-P软件进行无监督模式是别的主成分分析（principal component analysis， PCA）和非监督的正交偏最小二乘法判别分析（OPLS-DA）辨别分析。通过得分图比较各组样本组间差异，初步判断各组尿液代谢产物差异。

2 结果

2.1  步态观察

治疗结束后对大鼠进行步态评价，模型组与空白组、治疗组比较，差异均有统计学意义（P<0.05）。见表2。

2.2  关节肿胀度

通過观察大鼠关节肿胀度的改变，分析并且观察刺血结合药药线点灸对关节肿胀度的缓解作用。各组大鼠造模后关节周径均有不同程度的增加，与空白组比较差异有统计学意义（P<0.05）;造模后 12、24、48、72 h，治疗组关节肿胀程度低于模型组，差异有统计学意义（P<0.05）。见表3。

2.3  主成分分析（PCA）

PCA分析是一种无监督的多元变量统计分析方法，可以从多维空间反应各组样本之间的代谢差异和组间样本差异，是原始数据最初呈现的一种基本原始状态。本研究取空白组、模型组、治疗组大鼠治疗后的24 h尿液样本进行PCA分析。在PCA得分图上3组的样本点分散于不同区域，3组大鼠代谢图谱具有明显差异趋势，说明本实验造模方法可行。空白组的样本点主要分布在第一、四象限且比较集中具有一定的聚类性，说明组内大鼠内源性代谢物差异较小，代谢状态和变化趋势相对稳定;模型组样本点主要分布在第二、三象限且比较分散，治疗组样本点主要分布在第二象限且较，3组样本点无明显的交叉和重叠。治疗组大鼠代谢状态、变化趋势逐渐向空白组大鼠靠近。

2.4  偏最小二乘法判别分析（PLS-DA）

PLS-DA是一种有监督的多元变量统计分析方法，该方法与PCA相比，主要是在分析的过程中引入了一个新的变量（Y 变量），此变量具有分类信息，从而减少或删除组内差异对分类造成的干扰，其判别能力优于PCA分析。本实验使用SIMCIA-P12.0 软件对空白组大鼠和模型组大鼠采用 PLS-DA分析法从整体上进行了尿液代谢谱数据的模式识别，同时运用响应置换检验验证模型。PLS-DA分析的得分图和200次模型响应置换结果。治疗组与模型组的 PLS-DA 模型相关参数为：R2=0.926，Q2=0.645，得分图中的R2值代表模型的解释能力，Q2值代表模型的预测能力，Q2>0.5说明模型预测能力较好，模型有效;Q2>0.9说明此模型效果突出。模型响应置换结果为：R2=0.876，Q2=

-0.262，响应置换检验中的Q2<0则说明建模成功，没有出现过度拟合。本实验得分图中各组内的样本点也趋于集中，空白组与模型组之间分隔更远。通过置换检验，说明该模型的拟合度较好，进一步验证了本实验PLS-DA模型的构建是成功的。

2.5  正交偏最小二乘法判别分析（OPLS-DA）

OPLS-DA是PLS-DA的一种衍生运算分析方法，主要结合了正交矫正信号（OSC）和PLS两种方法，通过将X轴矩阵信息分解成与Y相关和不相关的两类信息，能够排除与分组不相关的一些变量，更准确的筛选出有价值的差异性变量从而使使判别能力更优。通过OPLS-DA分析过滤掉不相关的正交信号，结合差异性变量的重要性投影值（VIP）值，从而使获得的差异性代谢物更加可靠[9]。

本实验对空白组、模型组、治疗组大鼠进行了OPLS-DA分析，模型相关参数显示为：R2Y=0.841，Q2=0.732，均大于0.5，说明此模型构建成功，具有很好的拟合度和预测能力。从OPLS-DA得分图中可以看出空白组、模型组、治疗组呈现出明显的区分。其中，治疗组接近空白组。

2.6  差异性代谢物的筛选及鉴定

通过上述模型的识别与分析，确定本实验中3组大鼠尿液内源性代谢物存在显著的代谢差异，根据OPLS-DA分析中的VIP值显示出各变量的VIP值。VIP值越大，说明贡献作用越大。由于变量的平均VIP值都接近于1，故常将VIP>1的变量视为对模型具有重要意义。因此本实验筛选出16个VIP值大于1的变量，见表4。再以VIP>1和P-value<0.05为标准，并结合载荷图和T检验筛选候选变量，通过这些变量所代表的化合物的质谱信息，从HMDB、KEGG等数据库中查找出5个潜在生物标志物。见表5。

2.7  潜在生物标志物的代谢途径变化

将涉及的潜在生物标志物代入MetPA数据库进行分析，构建代谢通路，可知急性痛风性关节炎模型大鼠涉及的代谢通路包括：三羧酸循环、丁酸代谢、谷氨酸代谢、呲哆醇代谢等13条（见表6）。代谢通路影响值的临界点设置为>0.10，高于这个值将被选择作为潜在的靶标路径，丁酸代谢、三羧酸循环、半乳糖代谢，以及丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢这4条代谢途径在刺血结合药线点灸改善急性痛风性关节炎模型大鼠内源性代谢中起到重要作用。

3 讨论

壮医药线灸疗法是在中医学传统直接灸如麦粒灸、灯火灸等基础上，结合岭南地域气候等特点，经岭南壮民族长期特色医疗实践特点加以发展起来的[12]。其综合麦粒灸、灯火灸优势，再利用经药物浸渍后的特制苎麻线点灸相应穴位起到更为独特和广泛的作用。而刺血疗法又称刺络法、放血疗法，是中医学中最古老的治疗疾病方法之一，历代医家多用于急证、热证、实证，通过泻热排毒，疏通龙火两路达到阴阳平衡起到治疗作用[13]。付琳琳[14]等人认为此法可加快局部血液循环使关节沉积尿酸结晶代谢加快，从而缓解急性痛风性关节疼痛。

本实验通过对3组大鼠关节肿胀度、步态分析及尿液PCA分析，证明刺血结合药线点灸对急性痛风性关节炎有较好疗效。通过对急性痛风性关节炎大鼠尿液PCA、PLS-DA、OPLS-DA 等分析，从16种差异代谢性代谢物中筛选出5种与急性痛风性关节炎相关的潜在生物标志物及4条最可能的代谢通路，分别是：丁酸代谢;三羧酸循环;丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢;半乳糖代谢。

其中丁酸代谢通路与炎症反应关系最为密切，具有增强免疫力，抑制炎症反应，维护肠道健康的作用，可抑制内皮细胞的活化，减少细胞间粘附分子-1、血管细胞粘附分子-1释放[15]，从而抑制白细胞在血管内边集，并伸出伪足迁移至炎症组织中[16]。同时影响補体激活，阻碍炎症旁路途径的激活[17]。结合本研究结果可考虑刺血结合药线点灸通过影响模型大鼠体内具有抗炎作用的γ-氨基丁酸，以及可降低应激状态中炎症因子IL-6等水平的α-酮戊二酸，使丁酸代谢通路逐渐恢复正常，从而发挥抗炎作用，达到治疗急性痛风性关节炎的效果。

三羧酸循环、半乳糖代谢，能反映机体能量代谢水平[18]，急性痛风性关节炎期间，模型大鼠对能量的需求大大增加，炎症反应明显，机体的能量代谢异常[19]，α-酮戊二酸、柠檬酸、半乳糖苷1的含量升高，肌醇下降，导致三羧酸循环、半乳糖代谢发生障碍，而当大鼠经过刺血结合药线点灸治疗后，尿液中的α-酮戊二酸、柠檬酸、半乳糖苷1，的含量开始向正常值回调，体内异常的三羧酸循环开始恢复正常，机体的能量代谢趋向于恢复正常，炎性症状得到缓解、疼痛减轻。

丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢可刺激机体内的谷氨酰胺（合成γ-氨基丁酸的重要原料）生成增多。在治疗组大鼠接受刺血结合药线点灸治疗后，其尿液代谢物中的γ-氨基丁酸的含量与模型组相比下降，而γ-氨基丁酸是中枢神经系统中重要的抑制性神经递质，能通过调Ca2+通道，减少神经末梢递质释放，减轻痛觉[20]。可初步推断刺血结合药药线点灸疗法通过降低机体中γ-氨基丁酸的表达，从而减少谷氨酰胺合成，使异常的丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢逐渐恢复正常。

综上所述，本实验通过液质联用技术对急性痛风性关节炎大鼠尿液进行代谢组学分析，说明这几种内源性物质与人体代谢机制联系较为紧密。一定程度上反映急性痛风性关节炎大鼠体内代谢水平的变化，为监测疾病生理状态下体内代谢物的变化和痛风发作的预防和改善提供一定依据，为刺血结合壮药药线点灸对急性痛风性关节炎大鼠作用机制的深入研究奠定了一定基础，从而促进民族医药外治法发展。

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