实验大小鼠病原微生物检测技术及检测常见问题

章蓉 舒加乐

摘要：该文通过概括实验大小鼠病原微生物的检测技术及在检测工作中遇到的常见问题分析，对病原微生物质量控制的必要性进行阐明，为检测实验方法的建立提供参考帮助。

关键词：实验大小鼠;病原微生物;检测

中图分类号：R33 文献标识码：B doi：10.3969/j.issn.2096-3637.2019.19.032

0 引言

隨着我国实验动物科学的不断发展，实验动物质量有了质的提升，对使用的实验大小鼠的质量也有更高的要求。实验大小鼠质量污染可以分为2类：微生物污染、基因污染。微生物污染包括细菌病毒、寄生虫，基因污染包括基因漂移缺失。为保障动物使用者的生物安全和实验大小鼠的动物福利，对实验大小鼠病原微生物污染的检测显得更为重要

检测实验大小鼠的病原微生物种类是质量检测的主要目的[1]，其中的病原微生物主要指国标GB14922.2-2011中规定的细菌、病毒、寄生虫等等。快速、高效、准确的实验动物病原微生物检测方法可以提高试验结果的可信度。如果国标中规定的不允许出现的微生物被检出，轻的会引起实验大小鼠患病、影响试验的数据和结果拖延科研进程，重的可能会引起人畜共患病的传播流行，造成公共安全事故[2]。实验大小鼠微生物的检测必须得到重视，它是科研服务、公共卫生安全的基础保障。

目前最常用的检测方法有培养基检测法及酶联免疫吸附试验（ELISA）法等。其中使用的设备均是常规科研设备[3]。实验大小鼠病原微生物检测对专业水平要求很高，检测人员必须熟练掌握微生物学相关知识和实验操作技能。同时，病原菌检测的实验室环境必须受到严格控制，必须达到生物安全实验室标准。实验大小鼠病原微生物的检测工作较为复杂，样品污染可能出现在取样、运输、检测等各个环节。保证检测结果的准确也是工作的重点。

1 检测技术

1.1 培养鉴定技术

分离培养是实验大小鼠国标中检测细菌的标准方法，也是目前最常使用的一种细菌定性检测技术。不同类型、不同种类的微生物对培养基的要求不一样，因此在对样本进行细菌分离培养中，需要严格区分培养基的种类与范围。分离培养是利用在特定培养基中加入指示剂和反应底物，使目标病原菌产生特定的颜色形态或荧光等，将目标病原菌与其他杂菌相区分。之后将目标病原菌分离纯化，再用生化原理，对病原菌生长代谢中产生的特异性酶类进行鉴定。该检测方法具有直观性，对实验条件要求不高。但缺点是耗时长、操作复杂、需要操作人员有丰富经验。

1.2 免疫学技术

免疫学检测方法是国标中对培养条件苛刻的病原菌及病毒检测的标准方法，该方法是根据抗原抗体特异性反应对病原菌进行鉴定。包括酶联免疫吸附法、免疫磁珠分离法、双功能抗体检测技术、胶体金技术等。其中的酶联免疫吸附检测法（ELISA）是目前发展较为成熟的免疫学检测方法，是利用实验大小鼠血清中病原微生物产生的抗体与检测板中预包被的特异性抗原的结合，再辅以显色剂，使感染某种病原微生物并产生抗体的实验大小鼠血清可通过分光光度计的读数，进行判定的一种检测方法。该方法可用于检测国标中清洁级实验大小鼠必须排除的泰泽菌、支原体及病毒等。酶联免疫吸附法的优点是耗时短，操作简单，中间步骤少，避免了交叉污染等不确定因素对实验结果的影响。但其成本较高，且存在由于抗原特异性低而造成的假阳性结果。

1.3 分子生物学技术

PCR技术是一种聚合酶链式反应，可使极其微量的某一特定序列的DNA片段在应用特异性的引物扩增到百万倍以上，能准确地检测一些人工无法培养或难以培养的微生物，提高对实验大小鼠微生物感染的诊断检查内容和诊断能力。随着分子生物学检测技术的发展，PCR技术已在病原微生物的检测中广被泛应用[4]。而以PCR为基础的基因芯片技术也逐渐应用在其中。另外，PCR技术还可以通过使用通用引物，对其产物的序列进行分析，同数据库中已有微生物序列进行比对，进而准确鉴定病原微生物的种类，极大节约人力物力财力。PCR技术具有程序快捷、操作简单、检测灵敏及高特异性特点但其对引物特异性要求较高，需要特殊的实验仪器，对实验环境要求严格，一旦出现分子层面的体系污染，则很难彻底清除。

1.4 体内外寄生虫检测技术

体表寄生虫可以通过对实验大小鼠进行轻度麻醉后，根据寄生虫生活习性及寄居部位，直接在显微镜下镜检。体内寄生虫则需要将送检动物安乐死后，取盲肠内容物进行涂片和悬浮后，显微镜下进行镜检。直观快速的显微镜下直接镜检只针对成虫，而虫卵是实验大小鼠污染寄生虫的最大隐患，虫卵对恶劣环境及消毒剂的抵抗力也强于成虫，成虫一旦产卵，虫卵数量惊人，且很难彻底清除，因此，对寄生虫虫卵的检测显得更为重要，针对实验大小鼠体外寄生虫虫卵，可以麻醉后直接镜检，如螨虫虫卵通常会在实验大小鼠毛根处粘附的米白色、椭圆形虫卵，且很难从毛根处取下。实验大小鼠体内寄生虫虫卵，需排出体外后才能进行传播，因此可根据成虫产卵习性，进行检测，如蠕虫成虫通常会在实验大小鼠肛周进行产卵，使用透明胶带粘取肛周皮肤，再将透明胶带粘于载玻片上镜检，即可直接观察到成纺锤状虫卵。直接在实验大小鼠肠道内产卵的寄生虫，则需要在动物粪便中进行虫卵的检测，离心法、饱和盐水漂浮法等是常用检测寄生虫虫卵的方法。另外，PCR技术也可应用于寄生虫虫卵的检测。

2 常见问题

实验大小鼠病原微生物检测是一项较为复杂的工作，涉及采样程序、样品处理和留存、特定微生物检测程序和方法、人员操作和经验等，其中任何一个环节出现问题，都会对检测结果造成很大影响。

2.1 样品采集

采样不及时，常见于动物血液采集，在动物处于麻醉状态或刚刚死亡后需要及时采集新鲜血液样本，如动物死亡时间较长，血液已凝固，则无法采集到合格的新鲜血液用于血清提取。样本采集过程中，由于采样器械或操作环境问题，样本污染或多个样本之间交叉污染。样本采集时，未预留样本备份，在出现疑似阳性的情况下用于复检。很多工作者的检测意识不规范，在检测中忽略阳性和阴性对照组的设置，在检出阳性结果的同时不能判定是动物本身的卫生物污染还是在操作中使用的污染耗材，这就影响了最终结果的判定。由于引起实验大小鼠污染的微生物种类越来越多，许多国外引入的实验大小鼠也会带有致病性的微生物，这也需要检测人员具有更新更全面的专业知识。

2.2 应对方案

首先，检测实验室的工作人员必须有严格的无菌观念。这样既可防止试验操作中样品的人为污染，又可保障工作人员的生物安全。其次，检测人员需要不定期接受专业技能培训，用SOP规范检测人员的专业操作，提高责任意识。最后，做好完整的检测记录，及时整理归档，保证所有数据的可追溯性。这样可以准确跟踪到阳性污染大小鼠，及时处理，避免微生物污染的传播和扩大。

3 结束语

做好病原微生物的检测工作是实验大小鼠质量控制的重要手段，需要从不同的方向进行改进和努力，包括购买先进检测设备、完善检测规章制度、提高检测技能水平等。为得到高质量的检测结果，需要对每一个环节进行严格把控，这样才能更好为国家的科研事业保驾护航。

参考文献

[1]向志光，佟巍，张丽芳，等.实验动物国家标准中大小鼠微生物检测项目的考量[J].中国比较医学杂志，2016，26（2）：33-39.

[2]邹小娟.实验室实验动物人畜共患病的防控探讨[J].当代畜禽养殖业，2017（2）：45.

[3]费枫.畜牧兽医实验室人畜共患病的防控措施研究[J].湖北畜牧兽医，2017，38（11）：13-16.

[4]张越华，郑秀青.PCR技术在SPF级实验动物鼠检测中的应用[J].当代畜牧，2017（1）：46-48.

作者简介：章蓉（1979-），女，湖北人，高级实验师，硕士。