超声对亚麻籽蛋白稳定的水包油乳液理化性质的影响

徐珍霞 邓乾春 董绪燕 杨陈 魏芳 陈洪 黄凤洪 吕昕

摘 要：亚麻籽蛋白（flaxseed protein isolate，FPI）作为植物来源的优质蛋白，具有良好的乳化能力。本研究采用碱溶酸沉法提取得到蛋白质含量为90.8%的亚麻籽蛋白，分析不同超声乳化条件（40%功率，超声有效时间2、6、12、18、24、30 min）对含有大豆油的两种不同浓度（0.5%、1.0%，w/w）的亚麻籽蛋白稳定乳液的理化性质及流变性能的影响，发现在超声乳化30 min后乳液具有较小液滴尺寸，乳液的绝对Zeta（ζ）-电位值最高，显示出最佳的粘弹性。同时，相比低浓度蛋白乳液，高浓度蛋白稳定乳液显示出良好的液滴尺寸分布特征和更好的稳定性。结果表明，超声乳化处理30 min可明显提高乳液的稳定性及凝胶性。

关键词：超声;亚麻籽蛋白;乳液;理化性質

乳液是两种不相混溶的液相的非均相混合物，包括水包油（O / W）、油包水（W / O）或多重乳液（O / W / O或W / O / W）三种类型[1]，广泛应用于制药[2]、化妆品工业[3]、农业[4]和食品行业[5]中。作为一种热力学稳定体系，O / W乳液可以改善油溶性物质的水溶性，促进油脂的消化吸收，保护功能性物质的生物活性，并保证物质的储藏稳定性等[6]。目前，制备O / W乳液的研究方法之一是超声乳化技术，其主要是通过声空化现象，增强生物聚合物的功能特性，产生稳定的乳液[7-8]。Taha等[9]通过高强度超声处理制备出大豆分离蛋白稳定的乳液，证实超声是一种有用的乳化技术。同样，Yao等[10]发现，超声处理可有效提高肌原纤维蛋白-黄原胶乳液的稳定性，但未改变该复合物的官能团。蛋白质因其两亲性而适用作乳化剂，有利于乳液的形成[11]。其中，FPI不仅具有与大豆蛋白相当的氨基酸谱和营养价值，而且具有良好的乳化活性、热稳定性及高持油性等功能特性，其浓缩物具有高表面电荷，更利于形成稳定乳液体系[12-13]。Pham等[14]发现，与亚麻籽蛋白-酚类络合物稳定的乳液相比，具有高表面电荷密度的FPI稳定的乳液显示出更高的物理稳定性，说明FPI具有作为天然乳化剂的潜力。本研究以大豆油作为油相，通过超声乳化技术制备FPI稳定的O / W乳液，研究不同超声处理时间及两种FPI浓度对乳液理化性质的影响，并对乳液流变性能进行分析，为亚麻籽蛋白稳定乳液应用于食品及其他工业提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料 亚麻仁，大同市福瑞康鑫科技有限责任公司;大豆油，购自当地超市;尼罗红染料，上海源叶生物科技有限公司;正己烷、乙醇、盐酸、氢氧化钠等均为分析纯，国药集团化学试剂有限公司。

1.1.2 仪器 GAMMA 1-16 LSC冷冻干燥机，德国Martin Christ公司;Kjeltec TM 2300全自动凯氏定氮仪，德国福斯公司;T25高速剪切机，德国IKA公司;Nano DeBEE实验型超高压均质机，美国DeBEE国际有限公司;JY92-ⅡDN超声波细胞粉碎机，宁波新芝生物科技股份有限公司;Mastersizer 2000粒度分析仪，英国马尔文仪器有限公司;Zetasizer Nano ZS纳米粒度及Zeta电位分析仪，英国马尔文仪器有限公司;Nikon A1共聚焦激光扫描显微镜，日本尼康公司;DHR-2流变仪;美国TA仪器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 亚麻籽蛋白的提取与组分分析 以脱壳并经粉碎的亚麻籽仁为原料，将其与蒸馏水以1∶25的质量比混合溶解，用1mol/L NaOH调节pH为9.5，在60℃下水浴搅拌60 min后，以4 000 r/min离心30 min，得到的上清液用1mol/L HCl调节其pH为4.4，然后以4 500 r/min的转速离心1 h，弃去上清液，对得到的沉淀进行冷冻干燥并经研磨粉碎，即可得到FPI，储存于4℃备用。之后，采用凯氏定氮法测定所得FPI的蛋白含量（%N×6.25）。

1.2.2 乳液的制备 将蛋白质含量为90.8%的FPI粉末分散在Tris缓冲液（0.1mol/L pH 8.4）中，在室温下以500 r/min的转速搅拌16 h，并在40℃搅拌1 h以溶解蛋白质，制得FPI储备溶液（0.5%或1%，w/w）。将一定质量的大豆油加入到FPI溶液中（w/w=1∶10），乳液分两步制备。首先，使用磁力搅拌器在环境温度（25℃）下制备预粗乳液（2 500 r/min，30 min）。其次，将预粗乳液用高速剪切机在10 000 r/min下预均化2 min。再使用超声细胞破碎仪制备乳液，将40 mL粗乳液于超声幅度40%，脉冲持续时间为导通时间2 s和关断时间2 s的条件下，将样品超声处理2、6、12、18、24、30 min（其为有效处理时间，省略脉冲时间）制备乳液。同时，通过高压均质机将其在10 000 Psi的压力水平下均质以制备对照样品。

1.2.3 粒径分析 在制备乳液后立即使用Mastersizer 2000纳米粒度仪设备测定乳液的粒径。泵速和遮蔽率分别设定为2 000 r/min和10%～15%。其中，分散介质的折射率为1.330，大豆油的折射率为1.472。乳液的粒度用粒度分布（PSD）、体积平均粒径（d-4，3）和表面平均粒径（d-3，2）表示。

1.2.4 Zeta（ζ）电位测量 使用Milli-Q水将乳液稀释100倍，然后使用DTS-7010电位槽，在25℃通过Malvern Zetasizer Nano ZS（ZEN 3600）分析仪测量乳液的ζ-电位值。

1.2.5 乳液稳定性 将玻璃管中的新鲜乳液（20 mL）放置在室温黑暗环境中，在1、7、14d后观察乳液是否有分层或絮凝现象产生。

1.2.6 共聚焦激光扫描显微镜（CLSM） 使用尼康A1激光共聚焦显微镜观察新鲜乳液的形态以获得CLSM图像。使用尼罗红（以0.1% w/v的浓度溶解于乙醇中）用于油相染色，将40 μL上述染料加入到2 mL乳液中混合均匀后进行微观结构观察。激发波长为 488～530 nm，发射波长在575～580 nm之间。

1.2.7 流变测量

（1）应力扫描：使用具有铝平行板（直径40 mm、间隙1 mm）的DHR-2流变仪进行流变学测量。通过在1 HZ下进行的应变扫描测试，确定每个样品的线性粘弹性区域。在线性粘弹性区域内测量样品的粘弹性（储能模量G、损耗模量G″）。（2）频率扫描：频率扫描测试在25℃下，0.1～100 rad/s的角频率范围内进行。选择频率扫描测试的应变幅度为0.05%。（3）剪切速率扫描：稳定剪切试验在25℃下，1～100/s的剪切速率范围内进行，以测量乳液的表观粘度。

1.3 数据处理

试验处理重复3次，采用Excel 2007及OriginPro 8.0进行数据整理和图表绘制。试验结果以平均值±标准偏差表示。

2 结果与分析

2.1 乳液粒径测量

图1显示，对于两种浓度蛋白质（0.5%、1%，w/w）稳定的大豆油乳液，超声处理能显著降低液滴尺寸，随超声作用时间的延长，乳液的粒径随之减小。例如，从附表可以看出，对于蛋白质浓度为0.5%的乳液，相比均质处理，有效超声破碎30 min后，大豆油乳液的粒径从50.12±2.30 μm（H样品）降低至4.66±0.02 μm（S30样品），这些结果可能是由于声空化气泡的产生加剧了油滴的破坏过程[15]。另外，蛋白质浓度对乳液粒径有很大影响，对比两种蛋白浓度的乳液可发现，相比高浓度蛋白形成的乳液，低FPI浓度的乳液具有更大的液滴尺寸，原因可能是高浓度FPI作为乳化剂能更好地形成水包油乳液体系，该结果与Felix等[16]发现高浓度鹰嘴豆蛋白稳定的乳液具有较小液滴尺寸一致。

2.2 Zeta（ζ）电位分析

Zeta电位的绝对值越大说明分散体系越稳定，可根据它们的值来评估乳液的稳定性。如图2所示，观察到所有样品都具有负ζ电位值，这可能是由于FPI分子在pH值高于其等电点时带负电荷。对于蛋白质浓度为1%的乳液，超声处理后ζ-电位的绝对值显著增加，表明超声处理可将更多的负氨基酸暴露于FPI分子表面，乳液表面携带更多的负电荷，液滴之间的排斥力增加，乳液液滴的粒径相对更小，与粒径分析结果一致。而对于FPI浓度为0.5%的乳液，超声处理后乳液的ζ-电位绝值相差不大。而且，在同样处理条件下，蛋白质浓度为1%的乳液的ζ-电位值高于FPI浓度为0.5%的乳液，说明高浓度蛋白制备的乳液稳定性更好。

2.3 乳液稳定性

放置不同时间后乳液的表观图像表明，乳液主要是发生了乳化作用从而产生分层现象，而乳化是由于重力分离。可以观察到超声处理的样品较均质化样品稳定性更好，表明超聲产生更稳定的乳液。随着超声时间的增加，FPI乳液的稳定性增加。原因可能有两点：一是较长的超声作用可以显著降低油滴的大小，提高蛋白质的溶解度，从而促进FPI分子向油/水界面的运动;二是超声可使蛋白质展开并将疏水基团暴露在表面，从而促进油膜上FPI水界面的形成，形成稳定的水包油体系[17]。

2.4 共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）

不同浓度蛋白质稳定的乳液经均质和有效超声处理2、12、30 min后的共聚焦激光显微照片表明，大豆油用尼罗红染色后于激发/发射波长=488～530/575～580 nm处进行形态观察。以蛋白质浓度为1%的乳液为例，与均质相比，超声处理乳液显示出更小的粒径和更均匀的液滴，说明超声处理能降低乳液粒径并提高其分散性。在两种蛋白质浓度下，低浓度蛋白质稳定乳液显示出更大的液滴尺寸并显示出小规模的絮凝，说明高浓度蛋白有利于单分散乳液的形成。

2.5 流变

2.5.1 应力扫描 以FPI浓度为1%的大豆油乳液为代表，进行流变测量。图3显示了经均质处理和超声30 min处理乳液在固定频率（1Hz）下的储能模量（G）和损耗模量（G″）的应变依赖性。对于经均质处理的样品，G在低应变率（0.01%～5%，称为线性粘弹性区域）下大于G″，表明样品的弹性（固体状）行为。然而，当应变速率增加到足够高的水平（> 5%）时，G″变得大于G，从而揭示其中的粘性（液体状）行为[18]。而对于经超声30 min的样品，G和G″在低应变率下几乎一致，当应变增加到足够高（> 5%）时，G″变得大于G，表现流体特征，为粘弹性液体。

2.5.2 频率扫描 频率扫描测试在25℃下0.1～100 rad/s的角频率范围内进行，选择频率扫描测试的应变幅度为0.05%。图4表明，对于经均质处理的样品，随着频率的增加，模量呈现出增加的趋势，G″在低频率范围内大于G，揭示其粘性行为;当频率> 11 rad/s时，G变得大于G″，从而揭示其弹性行为。而对于经超声处理的样品，随着频率的增加，模量呈现出平缓增加的趋势，而后当频率达到5 rad/s时G=G″，之后G和G″均快速增加，且观察到在扫描频率范围内G大于G″，

表明在该频率范围内弹性行为是显著地，乳液体现出了典型的弱凝胶特性，显示出了样品的频率依赖性，而乳液的粘弹性响应通常可与凝胶状结构相关[19]，说明该乳液能够形成相当强的小液滴弹性凝胶网络。

2.5.3 剪切速率 剪切速率测试在1～100/s的剪切速率范围内进行，以测量乳液的表观粘度。从图5可以看出，经均质处理的乳液样品，在剪切速率1～10/s的范围内，其粘度保持不变，随后粘度呈现先增加后降低的趋势;经超声处理的所有样品的表观粘度值随着剪切速率的增加而降低，表明这些乳液样品本质上是剪切稀化的，为剪切变稀流体（假塑性流体）[20]。表观粘度与剪切速率曲线表明，每种剪切速率下表观粘度的大小随着超声时间的增加而增加，表明超声时间越长乳液的凝胶性越强。但超声处理30 min时乳液的整体粘度有所降低，原因可能是超声强度太大破坏了乳液的结构。

3 結论

采用超声乳化技术制备FPI稳定的O/W乳液，发现超声30 min后，1%FPI稳定乳液液滴分散更均一，粒径尺寸低至6.14 μm，乳液稳定性最好，显示出最高的粘弹性和凝胶特性。通过比较蛋白浓度为0.5%和1.0%的乳液理化性质，发现高蛋白浓度有利于形成均一稳定的乳液体系。

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（責任编辑 唐建敏）