桦褐孔菌对人体心肌细胞凋亡的颉颃作用分析*

李红艳

（西藏民族大学 高原环境与疾病相关机理研究高校重点试验室，陕西 咸阳 712082）

桦褐孔菌属于锈草孔菌科 ( Hymnochaeaceae) 多孔菌目 ( Polyporales ) 层菌纲 ( Hymenomycetes ) 白桦茸 (Inonotus obliquus) 种的植物，又被叫作桦树菇、西伯利亚灵芝等。16世纪以来，在东欧地区广泛使用该真菌来治疗疑难杂症，例如癌症、糖尿病、白血病以及心脏病等，并且均得到了较好的治疗效果[1-2]，引起了大量研究学者的广泛关注。近些年来，各个国家对桦褐孔菌展开了研究，发现桦褐孔菌可以降血压、抗病毒、抗氧化以及抗肿瘤。但该种真菌属于稀有真菌，2万棵桦树中大约有一棵树上会长出桦褐孔菌，野生的桦褐孔菌非常昂贵。桦褐孔菌对人体心肌细胞凋亡的颉颃作用也备受人们关注，本文就此问题展开研究。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种

桦褐孔菌310株，延边大学农学院的真菌试验室对其进行保存、分离处理。

1.1.2 培养基

固体培养基包括葡萄糖、黄豆粉和琼脂[3]，分别为2%、1%和1%， KH2PO4、MgSO4·7H2O分别为0.10%和0.05%。液体培养基中则不需要添加琼脂。

1.1.3 染色液

分别称取固蓝RR盐50 mg、乙酸-2-萘酯25 mg、乙酸-1-萘酯25 mg，并在其中添加丙酮3 mL，对其进行加热，加热到80℃～ 90℃固体溶解之后，再添加75 mL的染色缓冲液，最后获得酯酶同工酶的染色液。

1.1.4 H9C2细胞

该细胞来源于中国科学院上海细胞库。培养基和胰酶来源于美国hyclone公司，胎牛血清来源于杭州四季青公司； 氯化钴来源于美国Sigma司； 染色液来源于北京雷根生物技术有限公司； 双染细胞凋亡测试剂来源于上海贝博生物； 其他试剂均为国产分析纯[4]。

1.2 试验仪器

试验仪器有：低温高速离心机（Centrifuge 5417 R型），广州立诺自动化设备有限公司； 实时荧光定量PCR仪（StepOne TM型），美国应用生物系统公司；可见分光光度计（722型），上海光学仪器厂； 酶标仪（MR-96A型），上海永创医疗器械有限公司； 流式细胞仪（CytoFLEX型）， 贝克曼库尔特商贸（中国）有限公司；激光共聚焦显微镜（TCS SP8），北京德利卡生物技术有限公司。

1.3 方法

1.3.1 人体外细胞的复苏与培养

人体心肌细胞株复苏之后，添加RPMI-1640培养基，放在5% CO2、37℃、饱和湿度的箱中，每隔3d进行1次换液传代。人体心肌细胞传代到生长旺盛阶段时，再进行试验之前的24 h内换液，采用4 g·L-1台盼蓝染色3 min， 对人体心肌的活细胞进行观察，试验用到的细胞活性平均超过98%。

1.3.2 试验分组

将人体心肌细胞株进行随机分组，分成4组包括对照组和高、中和低3种剂量的桦褐孔菌提取物组，其中对照组中未添加药物，而提取物组中的高、中、低剂量的浓度分别为 80 mg·L-1、40 mg·L-1、20 mg·L-1。其中每组中设置4个样本。

1.3.3 药物处理

选取对数人体心肌细胞并在其中添加0.25%的胰酶来消化，制成含有1×106个细胞的悬液，悬液的含量为3 mL，将其放置于T-25培养瓶中进行培养，贴壁之后每个瓶子中加入2.7 mL的培养液和桦褐孔菌提取物0.3 mL的培养液[4]，使其浓度始终保持在 80 mg·L-1、40 mg·L-1、20 mg·L-1。在对照组中添加相同体积的生理盐水，并将该培养瓶放置在5% CO2、37℃饱和湿度的箱中，经过48 h之后收取桦褐孔菌提取物，并将其分给对照组和剂量组细胞。

1.3.4 人体心肌细胞活力测定

对人体心肌细胞进行接种，接种24 h之后，将其随机分为6组： control组、CoCl2组和桦褐孔菌组（设 4 个浓度梯度 ：25 μg·mL-1、50 μg·mL-1、100 μg·mL-1、200 μg·mL-1），每一组设有 6 个复孔。桦褐孔菌用DMSO配成100 mmol·L-1母液，各组用DMSO补足等体积。24 h之后，CoCl2组和桦褐孔菌各组分别加入CoCl2，使最终浓度达到500 μmol·L-1， control组用双蒸水补足等体积。在37℃下，继续孵育24 h， 利用CCK8法对人体心肌细胞活力进行测定。

1.3.5 Hoechst33342染色观察细胞的形态

细胞以每孔5×104（500 mL）密度接种于预先放有盖玻片的24孔板内。试验分成3组，分别有control组、CoCl2组和桦褐孔菌+CoCl2组。经过24 h之后，桦褐孔菌+CoCl2组加入终浓度为100μmol·L-1的桦褐孔菌预作用24 h，利用DMSO对体积进行补足。24 h之后，加入500 μmol·L-1在CoCl2组和桦褐孔菌+CoCl2组中，利用双蒸水对control组进行体积补足。并且在培养箱中对其培养24 h，按照Hoechst 33342说明书进行染色，在激光共聚焦显微镜下观察人体心肌细胞的形态。

1.3.6 流式细胞仪检测人体心肌细胞凋亡

利用PI荧光染色方法。对每组培养瓶中的人体心肌细胞进行收集，收集在离心管中，贴壁的细胞经过消化之后，与原瓶的悬浮细胞进行混合，1 000 r·min-1离心5 min，弃上清液，并在冷磷酸盐缓冲液中进行洗涤[5]，操作2次，随后调整为1×106个/mL，顺着管壁加入1 mL于-20℃预冷的70%乙醇， PBS进行2次洗涤可以有效去除固定液，加入800 μL PI染色液并将其混匀，在4℃避光下进行30 min的染色，每1组重复4次操作，随后上机检测。利用流式细胞仪[6]检测样品时，每次的细胞计数为6 000个。利用软件CellQuest[7]来检测人体心肌细胞的凋亡率。

1.3.7 统计学处理

利用SPSS 17.0统计软件处理所有数据，用“平均值±标准差”来表示结果。采用ANOVA分析法来检验统计学，以P<0.05为差异有统计学的意义。

2 结果

2.1 桦褐孔菌对人体心肌细胞活力的影响

桦褐孔菌醇对细胞的处理时间设置为24 h、48 h、72 h，桦褐孔菌对人体心肌细胞活力的影响见图1。

图1 与对照组相比Fig.1 Compared to the control group

由图 1可知，在 50～125 μmol·L-1范围中对人体心肌细胞活力提升效果不同，在24 h时，对照组细胞存活率为74%，而桦褐孔菌醇的浓度为50 μmol·L-1、75 μmol·L-1、125 μmol·L-1细胞存活率分别为75%、78%、82%，桦褐孔菌醇浓度在125 μmol·L-1内，细胞存活率增加，具有提升细胞存活率；24 h、48 h、72 h对照组的细胞存活率分别为75%、68%、64%，而试验组细胞存活率均有效提升，验证了桦褐孔菌对人体心肌细胞凋亡的抑制效果，具有颉颃作用。

2.2 桦褐孔菌对人体心肌细胞凋亡的影响

细胞仪的检测结果得到，桦褐孔菌醇会抑制人体心肌细胞的凋亡，提升细胞活力，见图2。

图2 桦褐孔菌对人体心肌细胞凋亡率的影响Fig.2 Effect of Inonotus obliquus on the apoptosis rate of human myocardial cells

由图2可知，桦褐孔菌浓度分别为50 μmol·L-1、75 μmol·L-1、125 μmol·L-1对人体心肌细胞处理48 h之后细胞凋亡率的最高点分别约为22%、17%和10%，明显比对照组的凋亡率（61%）低，说明其作用的剂量依赖性较为明显，且对心肌细胞凋亡的颉颃作用明显。

2.3 桦褐孔菌对人体心肌细胞Bax、BCL-2、Caspase-3和HIF基因的影响

经过CoCl2的诱导之后，人体心肌细胞凋亡基因Caspase和Bax得到了提高，而经过桦褐孔菌预处理之后明显下降，经过CoCl2诱导之后的人体心肌细胞抗凋亡基因BCL-2降低，桦褐孔菌在进行预作用的24 h之后有效降低，单独的CoCl2在对人体心肌细胞进行处理时，能够使HIF基因得到上升，桦褐孔菌经过预处理时候使HIF基因的降低效果十分明显，见图3。

图3 桦褐孔菌对凋亡基因的影响Fig.3 Effect of Inonotus obliquus on apoptotic genes

综合以上试验结果，桦褐孔菌能够抑制凋亡基因的产生，使经过CoCl2诱导后的人体心肌细胞凋亡基因Caspase和Bax的得到有效降低，同时使HIF基因下降，抑制人体心肌细胞的凋亡，颉颃效果明显[8]。

3 结语

近年来，在真菌药用植物中分离出较多的活性物质，说明药用植物中的真菌对开发药物能够起到重要作用。其中桦褐孔菌分作为重要的药用菌，能够有效改善当人体心肌细胞凋亡现象。桦褐孔菌在人体心肌缺血再灌注损伤中具有重要意义。但对桦褐孔菌对人体心肌细胞凋亡中的颉颃效果研究较为浅显。为了对其进行探讨选择人体心肌细胞当作研究对象，利用桦褐孔菌醇对细胞凋亡的颉颃进行检测，揭示了桦褐孔菌在细胞中的作用。通过试验可知，桦褐孔菌醇提升细胞的活力，并且利用流式细胞仪测试桦褐孔菌对人体心肌细胞凋亡的影响时，发现该真菌醇能够减低人体心肌细胞的凋亡情况，对心肌细胞凋亡具有一定的颉颃作用，也为桦褐孔菌的合理使用奠定了基础。