氧化对大豆分离蛋白溶解性的影响

采用2，2'-偶氮二（2-脒基丙烷）二盐酸（AAPH）在有氧条件下热分解产生过氧自由基，代表脂肪氧合酶诱导多不饱和脂肪酸脂质过氧化反应过程中产生脂质自由基，研究过氧自由基氧化对富硒大豆蛋白溶解性的影响。随着 AAPH 添加浓度的增大，大豆蛋白溶解性含量下降。

富硒;大豆分离蛋白;过氧自由基;功能性质

硒是人体必需的微量元素，以硒代氨基酸的形式存在于蛋白质中作为硒酶的活性中心发挥作用，其生物功能主要是抗氧化。研究表明，硒元素可以显著地提高富硒植物蛋白质组分的抗氧化活性，如富硒绿茶、富硒大米、富硒大蒜等。另外，江西丰城被誉为“中国生态硒谷”，土壤中硒元素平均含量为0.28 μg/g，为硒蛋白的研究提供了得天独厚的条件。由于硒与人体健康具有十分密切的关系，所以硒蛋白的研究有着重要的理论和实际意义。Chan等研究发现，富硒大豆中多达82%的硒是以SeMet和SeCys为主的高分子质量形态存在，蛋白含量达35-40%，可大量富集硒，总硒含量达0.13 μg/g，是普通不富硒大豆的200多倍，此外，大豆是世界上最重要的食品原料，可直接食用或用来生产植物油、豆浆、婴儿配方食品、豆腐、大豆粉等，所以富硒大豆具有作为新型富硒产品的天然优势。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

富硒大豆，江西丰城富硒基地，普通大豆（平均硒含量～ 0.017 μg/g），市售;2，2'–盐酸脒基丙烷（AAPH）、5，5'二硫代二硝基苯甲酸盐（DNTB）、1-苯氨基萘-8-磺酸（ANS）、过硫酸铵、β-巯基乙醇，美国Sigma公司;石油醚（沸程60-90 ℃）等化学试剂均为分析纯。

1.2 主要仪器及设备

RH-basic 1磁力搅拌器，德国IKA公司;LXJ-IIB离心机，海安亭科学仪器厂;SPX-250电泳仪，美国伯乐公司;FreeZone 12-Plus冷冻干燥机，美国Labconco公司;新世纪T6紫外分光光度计，北京普析通用仪器有限公司;Nicolet 5700傅里叶变换红外光谱仪，美国Thermo Nicolet公司

1.3 实验方法

1.3.1 大豆脫脂粉末的制备

新鲜粉碎好的富硒和普通大豆中分别加入五倍体积的石油醚，室温下搅拌脱脂4 h，重复五次，静置沉淀，上清液回收，沉淀物置于通风橱中风干。收集干燥脱脂大豆过80目筛的细粉于4 ℃冰箱备用。

1.3.2 大豆分离蛋白（SPI）制备

大豆分离蛋白的制备根据袁等人的碱提酸沉法并稍作改动，具体过程为：脱脂大豆粉末按1：10的料液比加水搅拌，用1 mol/L NaOH调pH至8.0，室温下低速搅拌2 h，离心（8000 g，20 min，4 ℃），残渣重复提取，取上清液用1 mol/L HCl调pH至4.5，静置0.5 h后再次离心（5000 g，20 min，4 ℃），充分弃去上清液，沉淀水洗两次后，加水并用1 mol/LNaOH调pH至7.0，加少许水经搅拌溶解后，在4 ℃下对水透析24 h，每6 h更换水一次，经冷冻干燥后4 ℃保存备用。

1.3.3 过氧自由基氧化大豆蛋白制备

过氧自由基氧化大豆蛋白的制备方法如下：将制得大豆蛋白溶于0.01 mol/L pH 7.4磷酸盐缓冲溶液，蛋白浓度为 10 mg/mL，其中含有 0.5 mg/mL NaN3。将一定质量 AAPH 溶解于大豆蛋白溶液，使AAPH 终浓度分别为 0、0.04、0.2、1、5 、25及 125 mmol/L，在 37 ℃避光条件下将混合液在恒温振荡水浴器中中速振荡反应 24 h。反应结束后将反应液置于冰浴中使之温度迅速降至 4 ℃以下，随后将反应液在 4 ℃条件下 15900 g 离心 1 h，移除少量冷却过程中出现不溶物质（非蛋白质沉淀）。最后将反应液在 4 ℃去离子水中透析 72 h，以除去残余未反应 AAPH，透析过程中每隔6 h更换一次去离子水，最后冷冻干燥得到过氧自由基氧化大豆蛋白，并置于 4 ℃条件下贮存备用。

1.3.4 溶解性

蛋白质溶解性的测定根据Bera & Mukherjee报道的方法，稍作改动。称取0.25 g样品溶于25 mL去离子水中，搅拌30 min，1 mol/L HCI或1 mol/L NaOH调节pH值7.0，再搅拌30 min，常温下离心（5000 g，15 min）。取适量上清液稀释后，福林酚法测定上清液中的蛋白质含量，以牛血清白蛋白为标准蛋白做标准曲线。

2 结果与分析

2.1 过氧自由基氧化对大豆蛋白溶解性的影响

溶解性是蛋白质其他功能特性的基础，溶解度可简单地用来表征氧化大豆蛋白聚集和变性程度，过氧自由基氧化修饰对大豆蛋白溶解性影响如圖1所示。从图可见，SPI溶解度随 AAPH 浓度增大而缓慢降低。这是由于低浓度 AAPH 氧化使大豆蛋白主要形成可溶性蛋白聚集体;但随蛋白质氧化程度增大，共价交联使可溶性蛋白聚集体进一步发生聚集，最终形成不可溶聚集体，导致氧化大豆蛋白溶解性下降。氧化过程中，相同浓度AAPH处理时SSPI的溶解度始终高于OSPI，再次说明可能是硒元素的抗氧化活性为SPI起到了一定的保护作用。

3 结论

以实验室自制低氧化程度富硒大豆蛋白为原料，通过不同浓度 AAPH 热降解形成过氧自由基氧化修饰得到不同氧化程度富硒大豆蛋白，研究过氧自由基氧化对富硒大豆蛋白溶解性的影响。研究表明，随 AAPH 添加浓度升高，大豆蛋白溶解性含量下降。

参考文献

[1] Molan，A.，J.Flanagan，W.Wei，et al.Selenium-containing green tea has  higherantioxidant and prebiotic activities than regular green tea [J].Food Chemistry，2009，114（3）： 829 - 835.

[2] Liu，K.，Y.Zhao，F.Chen，et al.Purification，identification，an d in vitro antioxidant activities of selenium- containing proteins fromselenium - enriched brown rice [J].European Food Research and Technology ，2012，234： 61-68.

作者简介：范婷（1989-），女，硕士研究生，研究方向为粮食油脂及植物蛋白工程。