昭通市腹泻患儿轮状病毒检测和基因型分析

木国法

[摘要]目的：研究2017年6月月-2018年12月云南省昭通市腹泻患儿轮状病毒感染的的分子流行病学，为研制适合本地区的Rv疫苗提供参考依据。方法：收集昭通市第一人民医院儿科2017年6月-2018年12月腹泻患儿的粪便标本106份，用“胶体金法”检测A组RV抗原，逆转录棗合酶链反应（RZ-PCR）法扩增VP7、VP4，对RT-PCR阳性标本进行测序分型。结果：106份标本中，30份检测到轮状病毒抗原。阳性率为28.3%;对30份阳性标本进行G基因型测序分型，测序成功22例，G9型20例（90.9%），G2型2例（9.1%）。30份阳性标本进行P基因型测序。测序成功30例，P8型23例（76.7%），P4型7例（23.3%）。结论：昭通市RV腹泻患儿以G9型为主要流行病毒株。P基因型以P8型为主。G型和P型的组合以G9P8型为主。

[关键词]轮状病毒;基因分型;腹泻

[中图分类号H R725.1 [文献标识码]A [文章编号]2096-5249（2019）06-0252-01

A组轮状病毒是引起婴幼儿严重腹泻的主要病原体。世界卫生组织统计每年大约引起61.1万婴儿和儿童死亡。在發展中国家，小儿腹泻是婴幼儿死亡的主要原因，仅次于肺炎，约90%的RV感染死亡病例发生在亚洲和非洲的发展中国家。我国每年有4万婴幼儿因RV性腹泻而死亡。目前尚无治疗RV腹泻的特效药，主要采用对症治疗，纠正脱水，维持电解质平衡，因此预防极其重要。

由于RV的型别众多且多变，因此病流行学相当复杂，各地区各时期流行株不同，因此广泛的RV构筑监视网，RV流行株的变化动态监测疫苗开发有必要的数据支持。本研究选择常见A组的6种RVVP7基因型基因型（g）的特异性引物和A组的5种RVVP4基因型（p基因型）特异引物，RT-PCR技术对婴幼儿RV腹泻的P和g基因型的分子流行病学研究，为了开发适合本地区的安全有效的RV疫苗提供流行病学依据，并对RV的流行病学检测提供科学数据。

1资料与方法

1.1一般资料：

收集2017年6月-2018年12月昭通市第一人民医院儿科腹泻患儿大便标本共106例。均为符合临床诊断标准的腹泻患儿。

1.2主要试剂：

A群RV诊断试剂盒，小量柱离心式/液体样品RNA/DNA抽提试剂盒，PCR扩增试剂，PCR产物鉴定利用琼脂糖凝胶电泳法。

1.3试验方法：

（1）RV的RNA提取及检测：采用“胶体金法”检测A组RV抗原，其操作步骤严格按照试剂盒操作：检测阳性标本用病毒/液体样品的RNA/DNA抽提试剂盒抽提RNA，将装有RVRNA的1.5.mL离心管置于-70℃冰柜备用。（2）逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）扩增RV的VP7全长基因及巢式-聚合酶链反应（net-PCR）VP7血清型分型。（3）巢式-聚合酶链反应（net-PCR）进行VP4血清型分型。

1.4统计学处理：

数据采用SPSS 17.0统计学软件进行分析，计量资料以（x±s）表示，比较采用t检验，计数资料以率（%）表示。

2结果

2.1.RV检测结果以及RV感染的年龄和性别分布在elisa中测量方法检测结果显示，粪便样本106人中，取30份粪便样本，阳性样本为28.3%。男女患儿比例2.0比1的差异没有统计意义（P>0.05）。7-18月的年段患儿中RV阳性率最高（73.9%），其他年段是0-6个月（7.0%），19-36个月（16.3%），37-60个月（2.8%），以此进行了比较，显示出了统计学上的意义（P<0.05）。

2.2.RV感染的时间分布特点RV腹泻全年发病，流行高峰在9-12月份。

2.3.G9型成为主要流行病毒株，P基因型以P8型为主，G型和P型的组合以G9P8型为主。

3讨论

2017年6月-2018年12月昭通市腹泻患儿RV阳性率28.3%，RV检出率在男性患儿和女性患儿之间无差异。

RV的VP7蛋白是位于其外壳的主要蛋白结构，目前已有27个G血清型和35个P基因型被确定。我国20世纪90年代RV感染以G1型为主，2001年以来G3型成为国内主要流行株。自1994年国内学者钱渊等首次报道G9型感染病例，近年来国内G9病例陆续出现报道，本研究显示昭通市2017年6月-2018年12月RV毒株以G9为主要流行株，G9作为以前稀少的流行株成为优势株，并且在昭通市流行中占主导地位。目前RV疫苗主要是针对4个主要的流行优势株（G1-G4）来控制RV感染，而CO型RV流行越来越普遍，很有可能成为继G1-G4之后第5种最为流行的血清型，RV疫苗的研制就应该引入所有常见的血清学中的中和抗原，这促使人们认识到G9型轮状病毒感染的流行病学意义。

RVVP4是组成RV的对蛋白酶敏感的非糖基化蛋白，目前引起婴幼儿腹泻的P基因型多为P8和P4型，本研究RVVP4基因分型结果显示：昭通市2017年6月-2018年12月P基因型以P8型为主，P4型次之。