养阴润目丸对干眼模型大鼠结膜上皮细胞中Caspase-3、Caspase-6表达的影响

王超群 李点 刘慧萍 李玲

〔摘要〕 目的 研究养阴润目丸对干眼模型大鼠结膜上皮细胞中半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-6（Caspase-6）表达的影响。方法 将50只SD雄性大鼠按随机数字法分成5组，10只/组，分别为正常组、假手术组、模型组、养阴润目丸组、杞菊地黄丸组。模型组、养阴润目丸组、杞菊地黄丸组3组均采用去势法建立干眼模型。各组予以相应干预，干预30 d后，取大鼠结膜上皮组织，采用Tunel法检测Caspase-3、Caspase-6的阳性表达率。结果 养阴润目丸组和杞菊地黄丸组结膜上皮细胞中Caspase-3、Caspase-6的阳性表达明显低于模型组（P<0.05）。结论 养阴润目丸对干眼的作用机制可能是与降低结膜上皮细胞中Caspase-3、Caspase-6的表达活性从而阻断相关细胞凋亡级联反应相关。

〔关键词〕 养阴润目丸;干眼;结膜上皮细胞;半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-6

〔中图分类号〕R285.5;R276.7       〔文献标志码〕A       〔文章编号〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2019.07.012

〔Abstract〕 Objective To study the effects of Yangyin Runmu Pills on the expression of Cysteine aspartase-3 （Caspase-3） and Cysteine aspartase-6 （Caspase-6） in conjunctival epithelial cells in a rat model of dry eye. Methods A total of 50 Sprague-Dawley （SD） male rats were randomly divided into 5 groups： normal group， sham operation group， model group， Yangyin Runmu Pills group， Qiju Dihuang Pills group， with 10 rats in each group. The model group， the Yangyin Runmu Pills group and the Qiju Dihuang Pills group were prepared as the models of dry eye by using the method of ovariectomy. Each group was given corresponding intervention. After 30d intervention， the conjunctival epithelial tissues were taken to test the positive expressive rate of Caspase-3 and Caspase-6 by Tunel assay. Results The positive expressive rates of Caspase-3 and Caspase-6 in conjunctival epithelial cells in the Yangyin Runmu Pills group and the Qiju Dihuang Pills group were significantly lower than that of the model group （P<0.05）. Conclusion The mechanism of action of Yangyin Runmu Pills on dry eye may be related to the inhibition of Caspase-3 and Caspase-6 expressive activities in conjunctival epithelial cells， thereby blocking the correlation of related apoptosis cascade reactions.

〔Keywords〕 Yangyin Runmu Pills; dry eye; conjunctival epithelial cells; Caspase-3; Caspase-6

干眼（dry eye disease， DED）是眼表的一種多因子疾病，特征是泪膜稳态的丧失并伴有眼表症状，其病因包括泪膜不稳定、泪液高渗性、眼表炎症与损伤和神经感觉异常[1]。干眼是眼科常见病，老年人患病多与自身因素相关，其患病率随年龄呈线性增长[2]。近年来随着手机、电脑、角膜接触镜的普及使用，睡眠时间的减少，空气污染等多种因素的影响，干眼的患病率逐步呈年轻化趋势[3-5]。项目组前期研究表明[6-7]，对于干眼的治疗，养阴润目丸具有良好临床疗效，而养阴润目丸治疗干眼的有效作用机制尚不明确，本项目组拟通过建立干眼动物模型，研究养阴润目丸对大鼠结膜上皮细胞中半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-6（Caspase-6）的表达的影响。

1 材料与方法

1.1  实验动物

清洁级7～8周健康SD雄性大鼠50只，体质量180～200 g，由湖南省长沙市斯莱克景达实验有限公司提供（动物许可证号：SCXK（湘）2014-0002）。所有动物均通过泪液分泌试验、泪膜破裂时间筛查，检查正常方可使用。统一饲养于湖南中医药大学SPF级动物实验中心，控制室温（23±2）℃，相对湿度53%～57%。

1.2  药品及主要试剂

养阴润目丸（湖南中医药大学第一附属医院药剂科提供），杞菊地黄丸（九芝堂股份有限公司，201505001）。Caspase-3（PB0183）、Caspase-6（BA3328）、4%多聚甲醛（AR1069）、Tunel检测试剂盒（MK1020）均来自武汉博士德公司。泪液检测滤纸条（天津晶明新技术开发有限公司，20150903）。

1.3  主要仪器

Shandon 325 型石蜡切片机（英国珊顿公司），MIAS医学图像分析系统（北航公司），研究型正置显微镜（olympus）。

1.4  分组与给药方法

按随机数字表法将50只SD雄性大鼠分成5组，10只/组，分别为正常组、假手术组、模型组、养阴润目丸组、杞菊地黄丸组。正常组不做任何处理，假手术组只切开阴囊而不切除睾丸及附睾，模型组、养阴润目丸组、杞菊地黄丸组3组大鼠参照干眼动物模型的操作[8-9]，切除睾丸及附睾。术后常规消毒、保温、分笼饲养。养阴润目丸组、杞菊地黄丸组分别以药物0.94 g/kg与生理盐水混悬液灌胃，1次/d;正常组、假手术组、模型组3组分别以生理盐水灌胃，1次/d，连续灌胃30 d。

1.5  Tunel法检测Caspase-3、Caspase-6

各组大鼠治疗30 d后，用10%水合氯醛（3 mL/kg）腹腔麻醉，剪刀分离大鼠眼球周边组织并剥离出眼球结膜上皮，4%多聚甲醛固定后冷存待检。常规石蜡包埋、切片。3% H2O2去离子水孵育10 min，蒸馏水洗2 min×2次，Proteinase K（1∶200稀释）消化10 min，滴加标记缓冲液（20 μL）2 h后，PBS（pH 7.2～7.6）洗2 min×3次，滴加封閉液室温保存30 min，滴加生物素化抗地高辛抗体（1∶100稀释），室温孵育10 min后，PBS（pH 7.2～7.6）洗2 min×3次，滴加Caspase-3或Caspase-6抗体（1∶100稀释），室温孵育30 min，PBS（pH 7.2～7.6）洗5 min×3次，然后DAB显色、复染、脱水、封片。高倍镜下观察每张涂片，至少观察5个视野以上，计数视野内的细胞总数，如细胞核中有明显的棕黄色或棕褐色颗粒即为阳性表达，即凋亡的细胞，分别计算其阳性细胞比率。

1.6  统计学方法

采用SPPS 17.0软件进行数据分析，实验数据以“x±s”表示。如符合正态性及方差齐性，则用多因素方差分析两两比较法;如不符合正态性及方差齐性，则用非参多重比较法。以P<0.05（双侧检验）为有统计学差异。

2 结果

治疗30 d后，正常组、假手术组结膜上皮细胞核内几乎无明显棕黄色或棕褐色，即Caspase-3、Caspase-6几乎无阳性表达;养阴润目丸组和杞菊地黄丸组结膜上皮部分细胞核内可见棕黄色沉着，及Caspase-3、Caspase-6存在不同程度阳性表达，分别与正常组、假手术组比较，结膜上皮细胞凋亡阳性比率差异均有统计学意义（P<0.05），但养阴润目丸组与杞菊地黄丸组比较差异均无统计学意义（P>0.05）;模型组结膜上皮细胞核内可见大量棕黄色沉着，即Caspase-3、Caspase-6大量阳性表达，结膜上皮细胞凋亡阳性比率分别同养阴润目丸组和杞菊地黄丸组比较差异均有统计学意义（P<0.05）。见表1、图1-2。

3 讨论

已有研究表明[10]，角结膜上皮细胞的凋亡，被认为是损伤眼表正常形态与功能的主要途径。处于细胞凋亡下游的蛋白酶家族Caspases家族在凋亡早期启动并传递凋亡信号，于凋亡晚期作用于不同凋亡底物，使其产生细胞皱缩、DNA断裂等凋亡特征现象[11]。Caspases-3是细胞凋亡效应子，其降解凋亡标志底物的活性最强[12]，是细胞凋亡蛋白酶级联反应的必经之路。而Caspases-6能被上游的启动子激活，作用于凋亡标志底物使细胞发生生化及形态学改变。Caspases-3和Caspases-6之间的相互活化可能与Caspase的级联放大效应有关[13]。因此，通过干预Caspases-3、Caspases-6蛋白酶的表达，就有可能阻断其相关细胞凋亡通路级联反应的发生发展。

干眼属于中医学“白涩症”范畴。临床表现为“不肿不赤，不得爽快，沙涩昏朦，名曰白涩”（《审视瑶函》）。中医学认为，“泪乃肝之液”（《银海精微》），“肾主津液，润养目珠”，当肝肾亏虚，泪液分泌不足，目失滋润，则致干眼。养阴润目丸具有滋养肝肾、生津润燥功效，治疗干眼，临床疗效显著。本研究发现，以模型组与正常组、假手术组比较，大鼠结膜上皮细胞中Caspases-3、Caspases-6阳性表达率均有显著性差异，证实细胞凋亡机制与干眼的发生发展关系密切。经过养阴润目丸的干预后，大鼠结膜上皮细胞中Caspases-3、Caspases-6的阳性表达率要明显低于模型组，由此我们推断，通过降低Caspases-3、Caspases-6的表达活性，以阻断相关细胞凋亡级联反应，可能是养阴润目丸有效治疗干眼的作用机制，其关键因素是否是养阴润目丸中的某些有效成分或是滋养肝肾治法，还有待进一步探索。

参考文献

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