烘烤期烟叶霉烂病病原菌的分离、鉴定及生物学特性

潘祖贤 蔡永占 何鹏飞 于 仰 谢金思 吴毅歆 蒋佳容 何月秋

摘  要：为明确云南省烘烤期烟叶霉烂病的病原，采用分子和形态学鉴定方法，依据柯赫氏法则，对病原菌进行分离和鉴定并将其命名为Rhi-1，并初步研究了该病原菌的生物学特性。结果表明，引起该病害的病原菌为米根霉（）。菌株Rhi-1的气生菌丝旺盛，质地疏松，孢子囊和孢囊孢子直径分别为53～123 μm和2.1～9.0 μm，两者均呈球形或椭圆形。孢囊孢子萌发的最高温度为44.6 ℃，水相介质中孢囊孢子热处理10 min的致死温度为54 ℃，菌丝体热处理30 min的致死温度为70 ℃，最适pH为7.0，最佳培养基为PSA。此结果为研究霉烂病发生机制提供了依据。

关键词：烟叶霉烂;米根霉;孢子囊;孢囊孢子

中图分类号：S435.72          文章编号：1007-5119（2019）04-0042-06      DOI：10.13496/j.issn.1007-5119.2019.04.007

Isolation， Identification and Characterization of the Pathogen of Tobacco Leaf Mold during Flue-curing

PAN Zuxian， CAI Yongzhan， HE Pengfei， YU Yang， XIE Jinsi，

WU Yixin， JIANG Jiarong， HE Yueqiu

（1. Yunnan Agricultural University， Kunming 650201， China; 2. Xuanwei Tobacco Company of Qujing Prefecture， Xuanwei， Yunnan 655400， China; 3. National and Local Joint Engineering Research Center for Screening and Application of Microbial Strains， Kunming 650217， China）

 In recent years， tobacco leaf mold has become a serious disease in tobacco producing areas of Yunnan Province. To clarify the pathogen of the disease， the pathogen was isolated， identified and its biological characteristics were also analyzed based on the Koch’s postulations， morphology observation and molecular technology. The results showed that the aerial hyphae of the strain Rhi-1 is vigorous and loose， with its sporangium diameter being 53-123 μm and its sporangiospore diameter being 2.1-9.0 μm， both being spherical or oval. Combining with the 16s rDNA-ITS sequence analysis， the strain Rhi-1 was identified as . The highest temperature of spore germination is 44.6 ℃， lethal temperature of the spores is 54 ℃ in hot water bath for 10 min and lethal temperature of the mycelium is 70 ℃ in hot water bath for 30 min. The optimal pH value is 7.0 and the optimal medium is PSA. These results could provide a good basis for pathogenicity studies of the pathogen.

： tobacco leaf mold; ; sporangium; sporangiospore

煙叶在烘烤过程中，均有可能发生霉烂，尤其是在初烤时，烟叶霉烂病发生严重。在烤烟房内发病时，叶柄处首先出现水渍状斑，变褐腐烂，病部缢缩软化，随后再由基部沿叶脉向叶片尖端延伸，表面着生大量白色菌丝并向叶基部扩展蔓延，后期菌丝体变为灰黑色，最终导致叶片大面积发霉腐烂。然而，目前对烟叶霉烂病的研究多数集中在储藏阶段，对烘烤期的烟叶霉烂病报道较少。当前国内已报道引起仓储期烟叶霉烂的优势病原菌为青霉属（）和曲霉属（）真菌。早先有报道认为红花大金元烟叶在烘烤过程中出现的叶柄霉烂是由于感染霉菌而引起的。最近不同烟草产区先后发现烘烤期烟叶霉烂的主要病原菌是米根霉（）。依据霉变的发生症状，将其划分为叶基霉烂型和叶片霉烂型。云南省个别地区在烘烤中部烟叶时，霉烂病发病率达30%以上，损失达20%左右，以叶基霉烂型为主。然而，该病的病原还不清楚。为了明确其主要病原分类地位、生物特性和制订防治策略，本研究对来自云南省宣威市的烤烟霉烂病标本进行了病原物分离、鉴定和生物学特性研究。

1  材料与方法

1.1  病原菌的分离

霉变烟叶样品于2018年8月采自云南省宣威市格宜镇石磨村烟草烤房，烤烟品种为云烟105（ cv. Yunyan 105）。从烟叶叶柄处挑取少量菌丝体，转入PDA平板，32 ℃黑暗培养3 d，转接继代培养3次，所得纯净菌株命名为Rhi-1。用滤纸片法保存纯化后的菌株Rhi-1，−80 ℃贮存备用。

1.2  病原菌的鉴定

1.2.1  形态观察  在PDA平板上活化菌株，挑取少量菌丝于光学显微镜下镜检。根据文献[6-7]的方法觀察病原菌形态特征并对病原菌进行鉴定，初步明确此菌株的分类地位。

1.2.2  分子鉴定  采用CTAB法提取基因组DNA。通过ITS扩增及测序鉴定此菌株。PCR扩增产物交由硕擎生物技术有限公司测序。应用NCBI-Blast和MEGA X等软件对所得到的序列进行分析，并在NCBI数据库中提交该菌株的ITS序列。

1.2.3  致病性测定  将菌株孢子悬浮液（1×10 cfu/mL）喷施在新鲜健康的烟叶柄表面。于32 ℃恒温箱内保湿黑暗培养。5 d后，观察叶柄的发病情况。分离发病烟叶柄处的微生物，并完成形态及分子鉴定。

1.3  生物学特征研究

1.3.1  温度对Rhi-1孢囊孢子萌发、孢囊孢子萌发活性及菌丝体生长的影响  将孢子液接种于PDA上，在36.8、37.9、39.1、40.1、41.1、42.1、43.3、44.6、46.0、47.4、48.5、49.5及50.2 ℃下培养。48 h后，观察记录菌株的生长情况。每个处理4个重复。同时将孢子悬浮液（10 cfu/mL）在不同温度（46、48、50、52、54、56、58、60及62 ℃）下处理10 min，并涂布于 PDA平板，32 ℃培养箱中黑暗培养。10 h后，统计萌发的孢子数。每个处理5个重复。将菌丝体在50、55、60、65、70、75和80 ℃条件下处理30 min后转入PDA平板，32 ℃黑暗条件下培养。3 d后，观察有无新生菌丝长出，计算存活率[存活率=（存活样本数/总样本数）×100%]和致死率{致死率=[（对照组存活率-处理组存活率）/对照组存活率]×100%}。每个处理20个重复。上述试验均重复3次。

1.3.2  pH对Rhi-1生长的影响  在pH分别为5.0、6.0、7.0、8.0和9.0的PDA平板中央处接种直径5 mm的菌饼，32 ℃恒温培养箱内黑暗培养。24 h后，采用十字交叉法测量菌落直径。根据菌落直径的大小判断pH对Rhi-1菌株生长的影响。每个pH处理15个重复，1皿/重复。

1.3.3  培养基种类对Rhi-1生长的影响  用水琼脂培养基（WA）、马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）、马铃薯蔗糖琼脂培养基（PSA）、燕麦琼脂培养基（OMA）、玉米粉琼脂培养基（CMA）、玉米粉葡萄糖琼脂培养基（CMD）及烟茎培养基（烟茎200 g，煮汁20 min，去烟茎、琼脂粉24 g、水1000 mL）培养菌株。其他具体操作同1.3.2。

2  结  果

2.1  烟草霉烂病病原菌的分离与鉴定

真菌菌株Rhi-1在PDA培养基上生长良好，气生菌丝旺盛，菌落初为白色，后期呈灰黑色，菌丝质地疏松，呈放射状生长，菌丝生长速度较快，2～3 d后即可长满整个平板（图1a）。菌丝无隔，分化出假根和匍匐菌丝（图1d）。孢囊梗单生或丛生，与假根对生，顶端着生孢子囊。孢子囊呈球形或近球形，初期无色或淡褐色，后期老熟变为黑褐色，囊轴明显，基部有囊托，孢子囊较大，直径53～123 μm。孢子囊成熟后散出大量孢囊孢子，孢囊孢子呈球形、卵形或不规则形，无色或淡褐色，呈透明状，光滑、无隔膜，直径大小为2.1～9.0 μm（图1b和c）。初步的形态学鉴定结果显示Rhi-1与根霉属（）真菌形态类似。

注：a.菌落形态;b.孢子囊（近景）;c.孢囊孢子;d.假根和孢子囊。

Note： a. colony on PDA plate; b. sporangia （nearby view）; c. sporangiospores;d. rhizoids and sporangia.

图1  Rhi-1菌株的形态特征

Fig. 1  Morphological characteristics of Strain Rhi-1

以菌株Rhi-1基因组DNA为模板，使用真菌ITS鉴定的通用引物ITS-1/ITS-4可扩增出长度为0.6 kb左右的DNA片段。BLAST同源比对的结果显示菌株Rhi-1与GenBank数据库中的一些米根霉（）菌株亲缘关系最近，ITS序列的一致性达100%。基于ITS序列（GenBank中的登录号为MH997437.1）的菌株系统发育树见图2，Rhi-1菌株与米根霉MB15、SPL16040等菌株的亲缘关系较近。综合形态学特征及ITS序列分析结果，可确定菌株Rhi-1为米根霉（）。

注：黑色三角形为Rhi-1菌株。

Note： the black triangle is the Rhi-1 strain.

图2  基于ITS序列采用邻接法构建的Rhi-1菌株

及其相关菌株的系统发育树

Fig. 2  Phylogenetic tree of Rhi-1 and related strains based on ITS sequences by the neighbor-joining method

2.2  Rhi-1菌株的致病性测定

将病原菌接种到烟叶3 d后，开始发病。病部中央区域首先有水渍状，变软，后期逐渐向周围扩大，呈腐烂状，严重时导致整个烟柄软化腐烂。叶柄失绿渐变为暗黄色，最后呈深褐色。同时，烟叶叶柄上开始出现白色毛发状菌丝体，随后菌丝体受潮易贴伏在烟柄表面使病组织散发出霉烂味（图3 B）。其症状与烤房内所发现的烟叶霉烂症状（图3 A）相似。从上述烟柄组织中分离真菌，并对该真菌进行形态特征观察以及分子鉴定，发现分离出的真菌与Rhi-1菌株完全相同。故确定菌株Rhi-1为引起烘烤期烟叶霉烂的病原菌。

注：A.烤房内的发病症状;B.人工接种的发病症状。

Note： A. Symptoms of infected tobacco in curing barn， B. Symptoms of tobacco inoculated with the Rhi-1.

图3  烟叶霉烂病症状

Fig. 3  Typical symptoms of tobacco leaf mold

2.3  温度对Rhi-1菌株生长的影响

2.3.1  孢囊孢子萌发温度  不同温度处理Rhi-1菌株孢囊孢子的结果表明，病菌孢子在36.8～43.3 ℃范围内均可萌发生长，但温度过高不利于孢子生存。温度为36.8 ℃和37.9 ℃的处理组内孢子萌发活性最高，长出的菌丝也最为旺盛并有黑色孢子囊出现（图片未显示），生长级数为9.0;39.1 ℃和40.1 ℃菌落生长级数减小至8.0和6.5，表现出一定程度地受抑制。随着温度的升高，高温对孢子萌发的抑制效果更为显著，42.1 ℃和43.3 ℃时孢子虽可萌发，但生长级数分别锐减至3.0和0.5，而在温度大于或

等于44.6 ℃的处理组，孢子无萌发，生长级数为0，显著地低于其他温度处理（<0.05）。此结果表明Rhi-1菌株孢子萌发的最高温度为44.6 ℃（图4）。

注：生长情况分级标准如下：0级，无菌丝;1级，极少量菌丝;3级，少量菌丝，仅能覆盖住培养基表面;5级，有一定量的菌丝体，气生菌丝层厚度中等;7级，菌丝和气生菌丝层厚度较多，但无黑色孢子囊出现;9级，菌丝和气生菌丝层均较多，有黑色孢子囊出现。不同字母表示5%显著差异水平。

Note： Grading of growth were based on follows： 0， no mycelium; 1， a little mycelium; 3， a small amount of mycelium， only covering the surface of medium; 5， a certain amount of mycelium; 7， more hyphae， but no sporangium appears; 9， black sporangium appears. Different lowercase letters indicate significant difference at <0.05 levels by Duncan’s test.

图4  温度对孢囊孢子萌发的影响

Fig. 4  Effects of different temperatures on sporangiospores germination of

2.3.2  水相介质中的孢囊孢子萌发温度  不同温度处理水相介质中的Rhi-1孢子，温度为46、48、50、52、54、56、58、60和62 ℃時，孢子致死率分别为14% a、23% b、30% c、57% d、100% e、100% e、100% e、100% e和100% e（数字后的字母不同表示在<0.05水平下差异显著性，下同）。当热处理温度为46～52 ℃时，致死率随温度的升高呈现出升高的趋势，当温度上升至54 ℃时，只有极少数的孢子存活、萌发并在PDA平板上形成菌落，数量显著低于46、48、50和52 ℃的温度处理（<0.05）。以上结果表明54 ℃热处理孢子液10 min即可导致其中的孢子完全失活。

2.3.3  菌丝体生长致死温度  以50、55、60、65、70、75和80 ℃的温度直接处理Rhi-1，其菌丝体死亡率分别为9% c、9% c、10% c、91% b、100% a、100% a和100% a。温度范围为50～60 ℃的处理（50 ℃、55 ℃及60 ℃）对Rhi-1菌丝的致死效应无明显差异且均未超过10%。将70 ℃及以上高温处理30 min的菌丝体转接到PDA平板上后，发现均无菌落扩展（图片未显示），显示菌丝体已全部死亡，致死率达100%。即，70 ℃直接热处理Rhi-1的菌丝体30 min可使之完全致死。

2.4  pH对Rhi-1菌株生长的影响

米根霉Rhi-1在pH为5～9范围内的PDA平板上均可生长。pH为5、6、7、8和9时，菌落直径分别为3.66 c、4.12 b、5.44 a、5.42 a、和3.14 d cm。其中在pH 7.0的PDA平板上培养1 d，菌落直径可达5.44 cm，显著地高于其他pH处理（<0.05），表明该菌株的最适宜生长pH为7.0。在pH为5.0和9.0的PDA平板上培养，直径均较短，表明过酸或过碱均不利于Rhi-1在PDA平板上的生长。

2.5  不同培养基对Rhi-1菌株生长的影响

使用不同培养基培养米根霉Rhi-1菌株，48 h后测定菌落直径。结果表明，病原真菌在供试的7种不同培养基中均能生长，其中在PSA培养基中生长最好，菌落平均直径可达8.50 cm，PDA次之，WA培养基中长势最差，菌落直径仅有1.83 cm（表1）。

3  讨  论

烟叶霉烂多发生于高温高湿，通风不畅的烤房，严重影响烟草品质和烟农经济收益。通过形态观察、ITS测序以及柯赫氏法则验证，采自云南省宣威市霉烂病叶的病原为米根霉（），与前人报道相一致。米根霉不仅引起烘烤期烟叶霉变，

还可引起仓储烟叶霉变及烟支霉变。米根霉作为一种弱寄生的致病菌，可引起多种作物的真菌性软腐病，如花生、红薯、向日葵、马铃薯等。但也有研究认为此类真菌能够发酵烟末并增加烟叶致香成分，在卷烟生产的其他流程中，它与曲霉等真菌在一定范围内可起到提高烟丝品质的作用。且不同时期，烟叶真菌优势种不同，格孢菌目为新鲜健康烟叶的内生优势菌群，晒黄烟调制过程中的优势菌群为附球菌属、节菱孢属和镰孢菌属，根霉属为复烤烟叶醇化过程中的优势类群，引起烟支霉变的微生物主要为球孢枝孢、黄曲霉、桔青霉和米曲霉。本研究显示米根霉为烘烤过程中的优势菌种，归于根霉属，与前人结果一致。

前人探究温度对菌株生长的影响时，采用的方法多为平板培养，将平板放置于不同温度的培养箱中处理，耗时耗材。本研究采用定量PCR仪的方法，相比前者，有用样量小、温度精准可控和试验周期短等优点，所得到的实验数据应当更加可信。结果表明，米根霉Rhi-1孢子萌发最适温度为36.8～37.9 ℃，高于44.6 ℃就不能萌发生长;在水相介质中，即使52 ℃下，仍有部分孢子萌发，菌丝在50 ℃时，便有部分死亡，在60 ℃时，死亡率达10%，温度达70 ℃以上时，便全部死亡。在36.8～40.1 ℃中，菌丝仍能保持良好生长，显示出对高温环境有较强的适应性，具有一定的嗜高温特性，这与烤房烘烤期的温度条件（36～42 ℃阶段式升温52 h）高度重合，且烟叶烘烤失水速率先增快后减慢，为米根霉的快速生长提供了适宜条件，暗示这一时期极有可能就是烟叶霉烂发生的主要时期。致病性测定结果显示，孢子喷雾接种烟柄，32 ℃健康烟柄显症仅需48 h，低于阶段式升温用时（52 h）。若综合温度因素，烤房内米根霉完成烟柄侵染的实际用时可能还要更短，加之空气流通，可能还会有多次再侵染。

值得注意的是，烤房里烟叶经历54、60以及68 ℃连续高温烘烤后，仍能从烟叶霉烂部位分离到存活的菌丝体。然而，菌丝体致死温度结果显示，65 ℃处理菌丝体30 min就能使绝大多数菌丝体失活。两者相差的原因可能与烤房内随着温度升高，相对湿度逐渐降低，菌丝渐干，耐受温度的能力逐渐提高有关。

许多报道认为，作物产后病害实际在田间就已经开始发生，且在大田时期的健康烟柄以及烤房内外等环境都分离到米根霉。实际中，我们也从健康的烟草叶柄以及烘烤前后的烤房内均收集到米根霉（数据未显示）。这些结果表明大田烟叶以及烤房周边的空气等是烟叶霉烂病的重要初侵染源，这为此病害后续的有效防控提供了重要的理论支持。

4  結  论

米根霉（）是引起云南省宣威市烘烤期烟叶霉烂病的病原菌。病原菌对高温具有较强的适应性，孢囊孢子萌发并生长的最高温度为44.6 ℃;菌丝体致死温度为70 ℃，30 min;水相介质中的孢囊孢子失活温度为54 ℃，10 min;烘烤期（36～42 ℃）是此病害的主要发生期。

参考文献

LI C Y， ZHAO G L， YE H Z， et al. Identification of dominant molds isolated from stored Henan tobacco and screening of fungicides[J]. Tobacco Science & Technology， 2011（7）： 64-68.

SU J E， YANG C， MI J H， et al. Control efficacy of agrochemicals to petiole mildew in Honghuadajinyuan tobacco leaves during flue-curing[J]. Acta Tabacaria Sinica， 2010， 16（3）： 64-66.

ZENG T Y， GU G， ZHANG S S. Pathogen identification of tobacco leaf mildew rot during flue-curing[J]. Acta Tabacaria Sinica， 2014， 20（4）： 65-68.

WANG Y D. Control and causes of tobacco mildew rot disease during flue-curing[D]. Fuzhou： Fujian Agriculture and Forestry University， 2016.

GU G， XIAO S， ZHOU T， et al. Development and prospect of research in tobacco leaf mildew rot during flue-curing[J]. Acta Tabacaria Sinica， 2018， 24（4）： 112-116.

HE Y Q. An improved protocol for fungal DNA preparation[J]. Mycosystema， 2000（3）： 434.

XU J L. Screening of antagonistic  to sunflower yellow wilt and study on biocontrol mechanisms[D]. Mongolia ： Inner Mongolia Agricultural University， 2016.

YAN W H， HUANG S L， ZHU G N， et al. Taxonomy and identification of microorganism causing mold damage of stored tobacco leaf in Guangxi [J]. Tobacco Science & Technology， 2008（2）： 50-56.

• XU M L， YANG J G， WANG F L， et al. First report of  （syn. ） causing root rot of peanut in China[J]. Plant Disease， 2015， 99（10）： 1448.
• MATHEW F M， PRASIFKA J R， GAIMARI S D， et al.  associated with  and stem disease of sunflowers （） in California[J]. Plant Health Progress， 2015， 16（1）： 39-42.
• CUI W G， ZHENG H L， ZHANG F B， et al. First report of  causing potato soft rot in the Hebei Province of China[J]. Plant Disease， 2019. https：//doi.org/10.1094/PDIS-09-18-1612-PDN.

YU Y S， SUN Y， LI Z H， et al.  effects on regular composition and the main aroma components of tobacco[J]. Journal of Yunnan Agricultural University （Natural Science）， 2017， 32（2）： 379-385.

LI P P， YUAN X L， ZHENG X， et al. The biodiversity of endophytic fungi in  and their cytotoxicity[J]. Chinese Tobacco Science， 2017， 38（3）： 74-79.

MI Q L， QIAN Y Y， ZHU Z H， et al. Fungal diversity analysis of yellow sun-cured tobacco leaves during curing[J]. Chinese Tobacco Science， 2017， 38（6）： 12-19.

WU G L， SUN W H， DONG G F， et al. Analysis of the dominant fungal population of flue-cured tobacco leaves during aging from different locations of Yunnan[J]. Chinese Tobacco Science， 2018， 39（3）： 66-72.

LI Y F， WANG R L， CHEN H X， et al. Identification and biological characterization of microorganisms resulted mildew cigarette [J]. Tobacco Science & Technology， 2017， 50（6）： 9-15.

ZHANG Y， WANG J F， XU X X， et al. Changes of water content， pigments and enzymes activities in tobacco leaves of different sections during flue-curing process[J]. Chinese Tobacco Science， 2018， 39（6）： 66-72.

CHEN E L. Influencing factors and prevention measures of mildew tobacco leaf during flue curing [D]. Zhengzhou： Henan Agricultural University， 2018.