海南蝴蝶兰种子无菌萌发研究

(1.湖南生物机电职业技术学院， 长沙 410127； 2.北京林业大学园林学院， 北京 100083)

海南蝴蝶兰(Phalaenopsishainanensis)又名海南蝶兰，是兰科蝴蝶兰属的多年生植物，为我国海南特有。因狭域分布、生境退化以及人工采挖，海南蝴蝶兰的种群数量明显下降，濒临灭绝，为我国Ⅰ级极危(CR)珍稀濒危植物，物种受威胁程度仅次于绝灭(EX)、野外绝灭(EW)[1]，对其开展抢救性保护刻不容缓。目前，海南蝴蝶兰在野外已经非常稀少，利用外植体直接进行诱导培养已经难以实现，且会破坏现有的少量植株，无菌播种是目前对其进行保存的重要方式之一。通过种子无菌萌发，可以在不破坏母株的情况下，在较短时间内获得大量幼苗，能有效地保护海南蝴蝶兰的种质资源，也为它的后续开发利用提供珍贵的原材料。当前，有关海南蝴蝶兰组培快繁的报道很少[2]。为了更好的保护海南蝴蝶兰，本试验对海南蝴蝶兰进行了无菌萌发研究，从基本培养基种类及有机添加物作用等方面进行了试验，并通过试管育苗成功培育出了一批海南蝴蝶兰幼苗。

1 材料与方法

1.1 材 料

表1 不同基本培养基对种子无菌萌发的影响

指标培养基处理1处理3处理5处理7处理9种子平均萌发率/%1.4±0.07a1.6±0.02d1.9±0.04e2.5±0.07b3.2±0.06c

注:不同小写字母表示在0.05水平上差异显著。下同。

试验材料为海南蝴蝶兰的成熟蒴果。

1.2 方 法

1.2.1蒴果无菌处理

取海南蝴蝶兰成熟蒴果，用洗洁精清洗表面，流水冲洗2 h，再用75%酒精表面灭菌1 min，无菌水冲洗2次，然后在10%NaClO溶液中消毒30 min。在无菌条件下，切开蒴果，取出种子，放入无菌水中，摇匀，制成种子溶液。

1.2.2无菌播种处理

取摇匀后的1 mL(显微镜下观测均值约1 000粒)种子溶液转移到无菌萌发培养基上，均匀分布。

为测定种子无菌萌发情况，设置了12个不同的处理。处理1：MS；处理2：MS+100 mL·L-1椰子汁；处理3：VW；处理4：VW+100 mL·L-1椰子汁；处理5：KC；处理6：KC+100 mL·L-1椰子汁；处理7：1/2 MS；处理8：1/2 MS+100 mL·L-1椰子汁；处理9：1/4 MS；处理10：1/4 MS+100 mL·L-1椰子汁；处理11：1/2 MS+100 g·L-1香蕉泥；处理12：1/2 MS+100mL·L-1椰子汁+100 g·L-1香蕉泥。每个处理均添加3%蔗糖、0.6%琼脂、0.2%活性炭(AC)，pH调节至5.6。控制温度(25±2)℃，光照强度30～40μmol·(m2·s)-1，光照时长14 h·d-1。

1.2.3植株再生处理

1) 原球茎的增殖与分化。

在1/2 MS+6-BA 2.0 mg·L-1+NAA 0.5 mg·L-1培养基上对种子萌发产生的原球茎进行增殖培养。

用1/2 MS+6-BA 0.5 mg·L-1+NAA 2.0 mg·L-1对增殖后的原球茎进行诱导分化。

2种培养基均添加3%蔗糖、0.6%琼脂、0.2%活性炭、100 g·L-1的香蕉泥，pH调节至5.6。控制温度(25±2)℃，光照强度30～40μmol·(m2·s)-1，光照时长14 h·d-1。

2) 壮苗与生根。

将分化后的幼苗转入MS+NAA 0.1 mg·L-1。

以上培养基中加入3%蔗糖、0.6%琼脂、0.2%活性炭、100 g·L-1香蕉泥，pH调节至5.6。培养温度为(25±2)℃，光照强度30～40μmol·(m2·s)-1，光照时长14 h·d-1。

3) 试管苗的移栽。

将试管苗(8～10 cm高、有6～8条粗壮的根、同时根长达4～8 cm)炼苗3～5 d，然后移栽在消毒过的水苔中。

2 结果与分析

2.1 不同基本培养基对海南蝴蝶兰种子萌发的影响

为探讨基本培养基对种子无菌萌发的影响，本试验分别设置了5个不同的处理。处理1：MS；处理3：VW；处理5：KC；处理7：1/2 MS；处理9：1/4 MS。每个处理为1种基本培养基。以种子形成绿色原球茎记为萌发。试验结果见表1。

由表1可知，海南蝴蝶兰种子在5种基本培养基上都能萌发，但差异显著。在1/4 MS上的萌发率最高。

2.2 不同有机添加物对海南蝴蝶兰种子萌发的影响

为研究有机添加物对种子无菌萌发的影响，本试验设置了4个不同的处理。处理7：1/2 MS；处理8：1/2 MS+100 mL·L-1椰子汁；处理11：1/2 MS+100 g·L-1香蕉泥；处理12：1/2 MS+100 mL·L-1椰子汁+100 g·L-1香蕉泥。结果见表2。

表2 有机添加物对种子无菌萌发的影响

培养基种子萌发率/%处理71.4±0.23c处理83.5±0.23a 处理111.9±0.12b 处理123.9±0.33a

从表2可以看出，椰汁跟香蕉泥均能明显促进海南蝴蝶兰种子的无菌萌发，100 mL·L-1椰汁与100 g·L-1香蕉泥相比，效果更显著。单加椰汁与同时添加椰汁、香蕉泥的培养基效果不明显。

3 结论与讨论

3.1 基本培养基

兰科植物无菌萌发常用的基本培养基有KC、花宝、VW、RE、MS、1/2 MS、1/4 MS等[3-9]。本试验结果表明海南蝴蝶兰无菌萌发的最适基本培养基为1/4 MS。

3.2 有机添加物

椰子汁、香蕉泥、土豆泥等有机添加物富含氨基酸、激素和酶等[10]，能促进兰科植物种子的无菌萌发[3,5,11-16]及幼苗的生长发育[7,17]。本试验结果与前人报道一致，有机添加物能明显促进海南蝴蝶兰种子的无菌萌发，100 mL·L-1的椰汁较100 g·L-1的香蕉泥效果更显著。

3.3 无机盐

无机盐的种类、配比、浓度会影响兰科植物原球茎的增殖和分化[18-19]。一般情况下较低浓度无机盐有利于原球茎的增殖[8]与分化[20]。本试验过程中，对种子无菌萌发产生的原球茎进行增殖培养，10 d后原球茎萌动，30 d后原球茎增殖明显，说明添加了100 g·L-1香蕉泥的培养基1/2 MS+6-BA 2.0 mg·L-1+NAA 0.5 mg·L-1适于原球茎增殖。把增殖后的原球茎转入添加了100 g·L-1香蕉泥的培养基1/2 MS+6-BA 0.5 mg·L-1+NAA 2.0 mg·L-1中，30 d后原球茎分化出芽，表明该培养基可用于海南蝴蝶兰的原球茎分化培养。

无机盐的种类、配比、浓度也会对兰科植物的壮苗生根产生影响。活性炭具有很强的吸附能力,能吸附分泌到培养基中的有害物质，减少褐变[4,21]，提高生根速率以及促进根伸长[22]。在培养基中加入活性炭，可有效防止试管苗褐变[11-12,23]。本试验将原球茎分化获得的幼芽接种于壮苗与生根培养基上，接种10 d左右的小芽下部开始膨大，产生绿色突起，30 d后生根，生根率100%。60 d后根系发达，每一植株均具5～6条粗根，且叶片肥厚，有4～6片。说明添加了100 g·L-1香蕉泥的培养基MS+NAA 0.1 mg·L-1适于海南蝴蝶兰的壮苗与生根培养。

3.4 移栽基质

水苔营养物质丰富，保水透气性好，为蝴蝶兰常用的移栽基质[17,24]。本试验中海南蝴蝶兰在壮苗生根培养基上继续培养，直到试管苗达到移栽要求时进行炼苗，然后移栽于水苔中，移栽30 d后，植株健壮，成活率100%，且叶片浓绿肥大，接近成株叶片大小，表明水苔适于海南蝴蝶兰的移栽。

3.5 研究意义

兰科植物常以叶片、花梗、根尖或茎尖为外植体进行离体保存，与这种方式相比，本试验采用的种子无菌萌发，能在短时间内得到大量幼苗，同时大幅度减少了试验对植物材料的需求量，极大地保护了珍稀濒危物种的现有数量，同时也降低了试验难度，缩短了试验时间，对海南蝴蝶兰种质资源的保护具有现实意义。