初治结核病患者肠道菌群变性梯度凝胶电泳指纹图谱分析

杨翰 李欢 郗隽 李爱芳 徐纪茹

共生微生物体积小，但数量及种类多，体细胞和共生微生物分布在人体皮肤、呼吸道、口腔和胃肠道、尿道等部位，形成一个复杂的生态系统[1]，其动态平衡与人体健康高度相关。其中肠道菌群在多个方面都对人体的健康起到重要作用，如降低胆固醇和血脂[2]、合成代谢维生素[3-4]，以及对人体的免疫力也有着重要作用[5-6]。已有研究证明，肠道菌群与全身多种疾病(糖尿病、关节炎、哮喘等)都存在着直接联系[7-9]；肠道菌群与癌症的免疫疗法提示其在疾病的治疗方面也有着良好的前景[10-12]；而结核病患者与肠道菌群的多样性也有着密切的关系[13-15]。本研究旨在分析正常人群与初治结核病患者肠道菌群的差异，对未来肠道菌群是否可以作为生物学标记，以及特殊的肠道菌群结构与结核病的易感性是否存在关联提供基础数据。

资料和方法

一、资料收集

1. 研究对象：于2017年8月至2018年7月每月固定时间在西电集团医院收集当天符合入组标准的健康体检成年人粪便标本2～3份，粪便标本进行-80 ℃低温保存，收集30份标本后停止纳入，作为对照组；收集2017年8月至2018年7月西安市胸科医院初步诊断为初治结核病患者的资料，同时对其粪便标本进行-80 ℃低温保存，待患者诊断明确后将粪便标本纳入研究(结核病患者诊断明确前收集粪便标本，有助于减少患者因用药带来的肠道菌群变化)，收集30份结核病患者粪便标本后停止纳入，作为结核组。

2. 两组人群入组标准：对照组入组标准，年龄0～70岁，身体质量指数(BMI)介于18.50～23.99，无其他身体基础性疾病(糖尿病、高血压等)。结核病患者入组标准，年龄0～70岁，BMI指数介于18.50～23.99，无其他身体基础性疾病(糖尿病、高血压等)，未使用抗生素进行治疗。结核病患者的诊断标准依据《WS 288—2017 肺结核诊断》[16]，诊断为初治活动性肺结核。

3. 一般资料：对照组中，女17名，男13名；年龄24～47岁，平均(33.00±8.22)岁。结核组中，男16例，女14例；年龄22～49岁，平均(33.00±8.63)岁。两组性别(χ2=0.07，P=0.795)和年龄(t=1.55，P=0.121)的比较，差异均无统计学意义，具有可比性。

二、研究方法

(一)仪器与试剂

C1000 Touch PCR仪、DCode变性凝胶电泳仪、Gel DOCTM 2000凝胶成像仪(美国Bio-Rad公司)；InGenius3凝胶成像系统(英国Syngene公司)；BD FACSCantoTMⅡ流式细胞仪(美国BD公司)。粪便提取试剂盒Stool DNA Kit(货号：D4015-01；美国Omega Bio-Tek公司)；丙烯酰胺、N, N′-亚甲基双丙烯酰胺、尿素、去离子甲酰胺(美国Promega公司)；琼脂糖(西班牙Biowest Agarose公司)；溴化乙锭(德国Sigma公司)；DL2000 DNA Maker、Premix Taq(日本TaKaRa公司)。

(二)试验方法

1. 粪便DNA提取：(1)将粪便内菌群与杂质分离，在2 ml离心管中加入最多200 mg粪便样品，并将离心管放在冰上。加入1.6 ml SLX-Mlus 缓冲液涡旋振荡直到粪便样品彻底均匀化；加入180 μl DS 缓冲液，颠倒混匀5次；全速离心(13 000×g) 3 min；取1.5 ml上清转移至新的1.5 ml离心管内。(2)将分离的菌群破壁并释放核酸，加入600 μl SP2 缓冲液，涡旋振荡10 s；于冰上放置5 min；全速离心(13 000×g) 3 min；取600 μl上清加入至新的2 ml离心管内；加入200 μl cHTR 溶液涡旋振荡10 s，室温放置2 min；全速离心(13 000×g)2 min；取600 μl上清至新的2 ml离心管内；加入20 μl蛋白酶K混匀；加入600 μl BL缓冲液，涡旋振荡10 s；70 ℃温育10 min，期间涡旋混匀2次；瞬时离心。(3)利用吸附柱纯化菌群核酸，取试剂盒自带吸附柱(型号：HiBind DNA Mini Column)插入新的2 ml 废液管；吸取6步所得液体600 μl(包含所有沉淀物质)至吸附柱内，全速离心(13 000×g)1 min，弃废液管内液体；重复7步2次，直到所有样本用完，使样本核酸固定在吸附柱上；将离心柱插入新的2 ml废液管，加入500 μl VHB缓冲液，全速离心(13 000×g)30 s，弃废液管内液体；加入700 μl DNA Wash 缓冲液，全速离心(13 000×g)30 s，弃废液管内液体重复10步，清洗掉除核酸外的其余杂质；将11步所得HiBind DNA Mini Column吸附柱空离2 min，并开盖室温放置2 min，保证无水乙醇全部挥发，以免影响核酸质量；将吸附柱转移至新的1.5 ml离心管内，加入200 μl 60 ℃预热好的Elution 缓冲液，室温放置2 min，全速离心(13 000×g)1 min，洗脱吸附柱上的核酸；上述收集的核酸保存于-20 ℃。

2. DNA扩增：选择细菌的16S rRNA-V3区的通用引物扩增V3区基因，通用引物为含有GC夹(含GC夹引物在DGGE电泳时防止双链完全解开)(5′-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGC-GGGGGCACGGGGGG-3′)的341F(5′-CCTACGG-GAGGCAGCAG-3′)和534R(5′-ATTACCGCGGCTGCTG)。扩增体系为Premix Taq 25 μl，引物341F-GC/534R(10 μmol/L)各1 μl，H2O 19 μl，DNA模板4 μl。PCR反应程序预变性 94 ℃ 5 min，94 ℃变性 30 s，退火温度初次设定为 56.5 ℃ 30 s，延伸 72 ℃ 30 s，33个循环。72 ℃ 7 min，4 ℃保存。PCR产物使用2%琼脂糖电泳验证是否有目标大小基因片段。

3. 变性梯度凝胶电泳[17](denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE)指纹图谱分析：30%～65%线性变性梯度聚丙烯酰胺凝胶配置，30%变性剂(100 ml)由40%双丙烯酰胺20 ml、50×TAE核酸电泳缓冲液2 ml、甲酰胺12 ml、尿素12.6 g，超纯水定容至100 ml，65%变性剂(100 ml)由40%双丙烯酰胺20 ml、50×TAE核酸电泳缓冲液2 ml、甲酰胺26 ml、尿素27.3 g，超纯水定容至100 ml。两种变性剂各加入10%过硫酸铵 200 μl、TEMED 40 μl，利用制胶器迅速灌入提前制好的垂直胶板中。将胶装置在电泳系统中，在新配置的1×TAE 电泳缓冲液中，以 150 V电压预电泳30 min，然后取10 μl扩增产物，与6×loading buffer 缓冲液混匀，加入到上样孔中，安装好电泳系统后，开始电泳：先以 60 V电压电泳1 h，后以 90 V电压电泳14 h，电泳温度设置为 60 ℃。电泳完毕后通过溴化乙锭溶液(0.5 g/ml)染色20 min，后用Gel DOCTM 2000凝胶成像仪凝胶成像系统进行成像标记。

4. 条带回收及测序：在紫外灯下，使用干净刀片仔细切下所选的主要条带。将凝胶使用Elution缓冲液冲洗2次后，将凝胶在20 μl Elution缓冲液中研磨碎4 ℃过夜后作为模板。改用V3区通用引物(不含GC夹)，反应体系及程序同第二步。使用琼脂糖电泳检测到目的条带后送至生工生物工程(上海)股份有限公司测序，将测序结果在NCBI BLAST(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)进行比对。

5. 肠道菌群多样性(细菌物种总数及丰富度)分析：使用Quantity One®1-D软件分析指纹图谱中的各样本条带数(每个条带代表一种细菌种类)和灰度值(代表该细菌核酸序列的数量)，获得菌群的香农-威纳指数(Shannon Wiener index；简称“H′指数”)。香农-威纳指数包含物种种数及各组间个体分配的均匀性，可以通过一个具体的数值来简单地反映菌群多样性的大小。公式如下[18]：

其中S为种数，Pi为样品中属于第i种个体的比例。同时对菌群进行非加权聚类分析(unweighted pair-group method with arithmetic means，UPGMA)。制作Dice相似性系数(Dice coefficient of similarity，简称“Cs”)累积曲线，横坐标为Cs值，纵坐标为小于特定Cs值的比率，曲线越靠近横坐标，表明组内菌群相似度越高。Cs值为两组样本间的相似度，在使用Quantity One®1-D软件分析样本时，各组样本中选择其中一例含有条带数最全的样本，以此为标准泳道，其他各样本泳道与该样本进行对比(包含条带位置与灰度值)，获得具体的Cs值。

三、统计学处理

图1 对照组1～15号患者的DGGE指纹图谱 图2 对照组16～30号患者的DGGE指纹图谱 图3 结核组1～15例患者的DGGE指纹图谱 图4 结核组16～30例患者的DGGE指纹图谱

结 果

一、DGGE指纹图谱分析

如图1～4所示(Marker为DL2000 DNA Marker)，整体观察其条带数、明亮度及位置，在不同样本中的差异代表着细菌种类的不同。对照组条带数为(13.57±3.37)条，H′指数为2.55±0.27，均明显高于结核组[条带数为(8.60±4.19)条，H′指数为1.99±0.52]，差异均有统计学意义(t=12.55，P<0.001；t=6.75，P<0.001)。对照组Cs值的M(Q1,Q3)为[22.90%(16.20%，29.30%)]，结核组Cs值的M(Q1,Q3)为[35.35%(23.73%，44.98%)]，两组通过Wilcoxon秩和检验比较，差异有统计学意义(Z=-73.38，P<0.001)。

注：右侧数字代表人群编号，对照组为1～30号，结核组为31～60号；横坐标代表距离系数图5 DGGE指纹图谱的聚类分析(基于Cs值的UPGMA分析)

二、UPGMA聚类分析结果

如图5所示，UPGMA聚类分析结果显示，对照组较好地聚集在了下支，说明该组内的菌种丰富度的分布较为相似，而结核组内各标本进化距离较远，聚集分散。

三、Cs值累积分布曲线分析

Cs值累积分布曲线分析见图6。对照组的组内相似度较结核组低(曲线越靠近横坐标轴，表明组内菌群相似度越高)。

图6 两组Cs值累积分布曲线

四、DGGE条带切胶测序及序列比对结果

条带测序结果显示，对照组与结核组的主要肠道菌群以Bacteroides属为主，Bacteroides属在两组间差异无统计学意义。但从表1中也可看出，部分种间存在差异。但结核组中Prevotella属的构成比低于对照组，差异有统计学意义，结核组Unculturedbacterium属的构成比高于对照组，差异有统计学意义。对照组肠道Prevotella/Bacteroides属的比值(32.96%，59/179)高于结核组(11.39%，18/158)，差异有统计学意义(χ2=22.15，P<0.001)。

讨 论

人体共生菌与机体的相互作用形成了一种稳定的微生态，这种微生态有利于人类健康。结核分枝杆菌的感染与肠道菌群的变化，两者的相互作用对机体健康有着一定的影响[19]。本研究的结果可以看出结核分枝杆菌对机体的感染、引起的免疫作用、对肠道菌群的改变有着直接的影响。

在DGGE的图谱分析中可以看出健康人群的菌群丰富度、多样性要高于结核组；在UPGMA聚类分析中，对照组聚类情况较好，结核组未能完全聚集在一起，也提示了对照组丰富度的相似性高，这与相关的报道也是吻合的[20]。结核病患者的机体免疫状态对肠道菌群起到了一定的选择作用，所以结核组相对于对照组内的相似性更高。后期测序结果发现，两组主要菌群还是以Bacteroides属为主，但是结核组内出现的Unculturedbacterium属克隆比例明显升高，以及Prevotella菌属比例下降，这可能是机体免疫选择的一种结果，还需要进一步研究。

笔者在对菌群成分分析时发现，肠道Prevotella/Bacteroides属的比值在两组间差异有统计学意义，对照组(32.96%)明显高于结核组(11.39%)。Sandberg等[21]的研究发现，Prevotella/Bacteroides属比值越高，越有利于肠道代谢。Kovatcheva-Datchary 等[22]的研究发现，肠道Prevotella属诱导在葡萄糖代谢改善中发挥作用，可能通过促进糖原储存增加。那么结核病患者肠道菌群中Prevotella属的下降是否会影响肠道的代谢，导致结核病患者消耗体质的发生，从上述的研究中似乎可以找到相应的证据，这也是下一步研究的方向。

通过上述分析，笔者发现机体在结核分枝杆菌感染发病的最初状态下，肠道菌群就发生了改变，结核分枝杆菌的感染对肠道内菌群有一定的选择性，因此组内相似性就越高。这表明结核病发病会对肠道微生态带来选择性的改变，影响着肠道功能，如吸收、代谢等功能。

本研究的DGGE分析也存在一定的局限性，肠道菌群种类较多，但指纹图谱中仅能反映主要的菌群，并不能完全反映出所有的信息。此外DGGE条带分析时，菌群含量差异造成条带亮度不同，在分析时会造成部分较暗条带丢失，导致肠道内菌群信息获得不全，而高通量测序技术在菌群的研究中可以更全面地获得信息。DGGE较宏基因组学分析方法虽然存在诸多缺陷，但因其试验成本低廉，结果直观，结果分析对生物信息学要求不高，目前仍然在该类研究中使用，适合研究人员对菌群的初步研究。

表1 肠道菌群在两组人群间的分布情况

综上所述，虽然DGGE技术存在一定的局限性，但能够客观地反映肠道菌群主要的差异，健康人群与初治结核病患者肠道菌群因为机体免疫状况的不同而存在差异，肠道菌群的恢复是否能改善结核病患者消耗性体质及预后也是未来的研究方向[23]。本研究仅对结核病患者在最初感染时的肠道菌群变化进行了对比。在结核病常规治疗中使用的抗生素会导致明显且持久的微生态失调，也是值得关注的问题[24]。