全蝎DNA条形码分子鉴定研究△

庞中化，王志刚，成小兰，胡春萍，曹鹏

江苏省中医药研究院/南京中医药大学 附属中西医结合医院，江苏 南京 210028

全蝎为钳蝎科动物东亚钳蝎ButhusmartensiiKarsch的干燥体，具有息风镇痉、通络止痛、攻毒散结的功效[1-2]。全蝎作为动物入药在我国有着悠久的历史，临床上广泛用于治疗类风湿关节炎、小儿惊风、癫痫、无名肿痛等[3-6]。由于全蝎药材价格高，且通常以粉末、中成药等形式入药，外部形态不完整或被破坏，混伪品增多，给全蝎药材鉴定带来极大的困难。线粒体COI基因被公认为动物界中标准的DNA条形码基因[7]。基于COI基因的中药DNA条形码技术建立和推广应用，有利于实现中药鉴定客观化、规范化和标准化。本研究拟利用DNA条形码COI序列对全蝎进行鉴定研究，通过对样品标准序列进行测序，建立全蝎DNA条形码数据库，实现全蝎的标准化快速化鉴定，为后续全蝎药材的分子鉴定提供新的方法。

1 材料

1.1 样品采集及鉴定

东亚钳蝎采自山东泗水、山西吕梁、河南伊川、河北邯郸、陕西绥德、内蒙古清水河、宁夏盐池、甘肃天水、青海贵德等地。所采集样本经南京师范大学戴建华教授鉴定，均为钳蝎科动物东亚钳蝎ButhusmartensiiKarsch，标本均保存于江苏省中医药研究院资源中心。伪品家鸡鸡肉购买自南京月苑菜市场。全蝎及其混伪品信息见表1。

1.2 仪器及试剂

水浴锅(XMTD-8222，上海精宏实验设备有限公司)；超速离心机(Eppendort 22331 Hamburg，德国Eppendorf公司)；ABI PCR仪(美国Applied Biosystems公司)；琼脂糖凝胶电泳仪(PowerPac UnlversalTMPower Supply，美国伯乐Bio-Rad公司)；凝胶成像系统Gel Doc XR(美国伯乐Bio-Rad公司)。

琼脂糖凝胶粉(BIOWEST REGULAR AGAROSE G-10)；染料(GelRedTM10000X inwater)；聚合酶(EneraldAmp Max PCR Master Mix 2X Premix)；引物(金斯瑞生物科技有限公司合成)；ddH2O；DL 2000 DNA Marker[宝日医生物技术(北京)有限公司]；基因组DNA小量试剂盒购买自AxyPrep。测序工作委托金斯瑞生物科技有限公司完成。

2 方法

2.1 全蝎基因组DNA提取

从液氮中取出保存的全蝎样本，放入研钵进行研磨使组织充分破碎，后加入1.5～2.0 mL 56 ℃预热的PBS溶液，继续研磨至组织溶液分布均匀。后续提取DNA步骤按照AxyPrep基因组DNA小量试剂盒依次完成实验。

表1 全蝎样品及混伪品来源信息

2.2 COI基因的PCR扩增

用试剂盒提取获得的基因组DNA，利用通用引物(LCOI490：GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG与HCO2198：TAAACTTTCAGGGTGACCAAAAAATCA)进行扩增[8]。40 μL PCR体系中包括：PCR Master Mix 20 μL，引物LCOI490与HCO2198各1 μL，DNA 4 μL以及去RNA无菌水14 μL。PCR循环参数：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性1 min，50 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，共40个循环；4 ℃保存。

2.3 琼脂糖凝胶电泳及测序工作

用电子天平称取1 g琼脂糖粉，置于装有50 mL 1X TAE溶液的锥形瓶中，用微波炉加热至完全溶解，冷却片刻后加入5 μL染料，摇晃至充分混匀，倒入胶槽等待其完全冷却凝固。取3 μL PCR扩增产物和DL2000 DNA Marker在2%的琼脂糖凝胶中电泳分离，在凝胶成像系统中拍照并保存，以确定COI目的序列被准确扩增。PCR产物进行双向测序，由南京金斯瑞生物科技有限公司完成。

2.4 测序数据的拼接及分析

返回的序列数据采用Chromas软件打开。样品经送测序完成后均获正向和反向两条序列，将同正向序列比对，反向序列进行反向补，校正结果，确定序列准确无误。然后在NCBI中用Blast程序进行相似性检索，以确定基因片段的准确性。用Mega软件对上述序列进行比对。整理所得数据，采用NJ(邻接)法对序列构建一个系统聚类树，同时再把所有序列用MEGA 6.06软件比对并对其进行遗传距离等分析。

3 结果

3.1 东亚钳蝎样本的野外采集及流通市场调研

我们采集的东亚钳蝎正品均为野外采集，蝎子为昼伏夜出物种，晚上出来活动及捕食。采样过程：东亚钳蝎在紫外灯光的照射下发荧光，很容易辨别，通常在蝎子容易出没的农村山脚下，石头缝内容易捕捉到，采集的样本为东亚钳蝎主产区的大部分范围，具体的采样地点参见表1。活体样本放入整理箱内带回南京实验室，由南京师范大学戴建华教授进行个体鉴定。我国国内蝎子的主要流通方式：当地农民采集，每隔几天会有相应的小贩到农民处收购，后有更大的商贩再从小商贩手中收购，最后主要于洛阳中药材市场集散交易，也有药厂直接从大商贩处定点产地采购，最终东亚钳蝎被炮制成全蝎饮片进入中药厂或各大药店及中医医院入药使用。

至于混伪品，全蝎打成粉后呈土黄色，与鸡肉粉颜色相仿，通过常规的形态学鉴定往往很难区分，加上不法商家的一些伪造手段，导致药材相对混乱。因此亟需一种新的快速鉴定方法，来鉴定全蝎药材中的混伪品，继而有效帮助建立良好的全蝎药材市场秩序。

3.2 东亚钳蝎DNA提取与PCR扩增

实验结果表明，东亚钳蝎的COI基因片段可用通用引物扩增出来，长度与DL2000 marker 700 bp序列相近，与理论大小(658 bp)一致，且无非特异性扩增(见图1)。PCR产物可用于测序，测序成功率为100%。本实验共测序东亚钳蝎正品310份，前期实验凝胶电泳验证东亚钳蝎的COI基因片段被成功扩增出来，且无非特异性条带，证明引物序列及PCR条件稳定可靠，后续样本PCR产物直接送至金斯瑞公司测序。

图1 COI基因PCR产物琼脂糖凝胶电泳鉴定

3.3 全蝎单元型间遗传距离及种群遗传结构分析

本次研究共采集东亚钳蝎正品310条序列共有35个单元型。35个全蝎单元型之间的遗传距离在0.14%～5.42%，在种内遗传距离范之内，表明所分析的个体为同一个种。东亚钳蝎单元型多样性Hd=0.970，核苷酸多样性Pi=0.031 27。整个种群高的单元型多样性和核苷酸多样性(h>0.5，π>0.5%)意味着种群是由多个地方种群混合而成的大而稳定的群体，或分化支系的二次接触形成。

如表2所示，对不同采集地区的东亚钳蝎进行分析，显示种群内遗传距离范围为0.00%～3.48%。其中种群1(山东泗水野生种群)、种群2(山东泗水养殖场种群)、种群4(山东沂水凤凰养殖场种群)、种群5(山东兰陵野生种群)、种群6(山东蒙山养殖场种群)、种群8(山西平陆安铺养殖场种群)、种群12(陕西榆林开源养殖场种群)内遗传距离在2.56%～3.46%，明显大于其他种群内的遗传距离。东亚钳蝎养殖场种群的遗传距离明显高于其他野生种群，推测为因适应养殖的需要，养殖场对当地捕获的东亚钳蝎与其他地区的优势种进行了杂交，因此其遗传距离明显高于其他野生种群。

3.4 系统发生分析

如图2所示，基于东亚钳蝎COI序列构建分子系统发育树，研究东亚钳蝎物种的进化关系。本次分析同时加入已经报道的东亚钳蝎序列JF700146.1、JF700145.1[8]和ZGYD0186[9]，已报道的3条序列均涵盖于本研究采样分析的35个单元型中。JF700146.1、JF700145.1和ZGYD0186序列均可以有效聚类，其中JF700146.1与QX0006MSY(山东蒙山地区)为同一单元型，JF700145.1与QX0003HDY(河北邯郸地区)为同一单元型，ZGYD0186与QX0001LYY(河南伊川地区)为同一单元型。伪品家鸡肌肉粉末(鸟纲)可以很明显地与东亚钳蝎(蛛形纲)正品分开，显示出于COI基因在种间鉴定的准确性。基于COI基因的全蝎DNA条形码技术鉴定正伪品有效、可行。在我们的样本采集中，来自宁夏盐池县青山乡海子塘野生种群、山东沂水前官庄村附近野生种群和青海海南藏族自治州贵德县河西镇园艺村野生种群可以聚类在一起；而来自陕西榆林开源蝎业有限公司王家沟养殖场种群、内蒙古呼和浩特清水河县城关镇八龙湾村野生种群及山西运城平陆县曹川镇下涧村野生种群较为离散，分布在不同的分支，显示出该地区东亚钳蝎样本的基因多样性。东亚钳蝎作为地球生物的“活化石”，已在地球上存活超过2亿年，进化上即便相对保守的COI基因，在种内的突变也要显著高于其他物种。

表2 全蝎种群内(对角线值)及种群间遗传距离

图2 基于COI序列构建的全蝎NJ树

4 讨论

全蝎是一种名贵的中药材，又名钳蝎、全虫、蝎子，古书上称虿。在中国产地达十几个省份，有十余种，统称东亚钳蝎。《蜀本草》记载，入药有1100多年的历史，因主要产于沂蒙山区腹地的临朐、沂水、沂源、蒙阴、平邑等县，故名沂蒙全蝎。但是随着我国人口的不断增长以及中药产业的快速发展，全蝎药材市场出现大量的混伪品，比如全蝎打成粉后与鸡肉颜色相仿，通过传统方法很难鉴别。本课题通过野外样本采集，采集了主产区的东亚钳蝎正品，并从市场上购买伪品家鸡鸡肉，通过DNA提取、PCR扩增COI基因，建立基于COI基因的东亚钳蝎正品数据库；通过数据库比对，很容易将正品全蝎与伪品家鸡进行区分，而且两者相差很大。东亚钳蝎为无脊椎动物蛛形纲下的生物，而家鸡为卵生的脊椎动物，在进化上两者差得较远，通过COI数据库比对很容易进行快速鉴定，可以看出，DNA条形码技术能高效、准确地鉴别中药材全蝎及其混伪品，继而有效帮助建立良好的全蝎药材市场秩序。