不同产地蟾酥药材HPLC指纹图谱及模式识别研究△

成小兰，庞中化，王志刚，胡春萍，吕章明，曹鹏

江苏省中医药研究院/南京中医药大学 附属中西医结合医院，江苏 南京 210028

蟾酥为蟾蜍科动物中华蟾蜍BufobufogargarizansCantor或黑眶蟾蜍BufomelanostictusSchneider耳后腺和皮肤腺干燥分泌物，主产于河北、山东、四川等地。蟾酥味甘、辛，性温，有毒，具有开窍醒神、解毒、止痛等功效，主治恶疮、瘰疬、癌肿、咽喉肿痛、牙痛等局部结肿及其引发的疼痛[1]。近年被用于治疗急性心力衰竭、慢性支气管炎、坐骨神经痛等[1-2]。现代药理学研究表明，蟾酥具有抗肿瘤、强心、局部麻醉、镇痛、抗炎等多种作用[3]。最新研究显示，蟾酥可增强去甲肾上腺素所引起的大鼠输精管的收缩，并呈剂量依赖性收缩反应。此外，蟾酥还具有镇咳、利尿、兴奋肠道平滑肌以及促进糖元抑制乳酸生成的胰岛素样作用[4]。蟾酥含有大量蟾蜍毒素类物质，尚含有酯蟾毒配基-3-单辛二酸脂、蟾毒灵-3-单辛二酸酯、华蟾毒精-3-单辛二酸酯、胆固醇、吲哚系碱类等成分，其中蟾蜍毒素类成分是蟾酥的主要有效成分[5-7]。蟾酥是临床常用的名贵动物药之一，应用广泛，疗效确切。众多成方制剂如六神丸、麝香保心丸、蟾酥注射液等均含有该药材。由于蟾蜍基原动物的多样化，加之中药大品种的技术升级以及蟾酥资源需求量的增加，蟾酥价格不断高涨，不法商贩在蟾酥中掺假以谋取暴利，导致市场商品蟾酥品种混杂、掺杂、掺假现象严重，常见掺伪品主要包括：淀粉、泥沙、蛋白、松香粉、牙膏、肥皂、猪油等杂质[8]。混伪品导致蟾酥质量差异较大，不能保证用药的有效性和安全性。因此建立有效可靠的蟾酥药材鉴定方法，用于严格控制蟾酥药材及饮片的质量显得尤为重要。

蟾酥常用的传统真伪鉴别方法包括外观形状鉴别和理化鉴别。但由于蟾酥经过初加工后，缺乏基原动物的外观形态，传统鉴别法存在一定的局限性。近年来，随着DNA分子鉴定技术的发展，基于COI基因条形码技术的药材分子鉴定为动物药材的鉴别提供了全新而有效的辅助手段[9]。但由于蟾蜍是两栖类动物，且该两栖类物种基因组受环境影响较大，基因组存在较大的变异性，单纯依靠COI测序难以对蟾蜍进行鉴定。此外，在蟾酥加工过程中，DNA受到较大破坏，因此难以从蟾酥中提取线粒体DNA，更增加了通过条形码鉴定混伪品的难度。中药色谱指纹图谱是一种综合的、整体的鉴定手段，可较全面地反映药材/饮片的化学成分以及特征峰面积的相对比例。在对药材/饮片指纹图谱分析的基础上，采用不同的统计处理方法进行化学模式识别，可在药材/饮片质量、产地、种属、真伪的判别中克服人工鉴定的主观因素，从而更加准确地对药材进行真伪鉴别和质量评价，应用广泛[10-11]。本研究采用HPLC梯度洗脱法构建不同产地蟾酥药材指纹图谱，并对10批样品进行相似度评价、聚类分析和主成分分析，旨在为蟾酥的质量控制和鉴别研究提供科学依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器

Waters 2695高效液相色谱系统，Waters2996型二极管阵列检测器，Empower色谱工作站(美国Waters公司)，METTLER AB204-S万分之一电子天平，METTLER AG285十万分之一电子天平，Milli-Q纯水器(美国Millipore公司)

1.2 试剂

甲醇、乙腈为色谱纯(美国TEDIA公司)；水为超纯水；其他试剂为分析纯。

1.3 对照品

蟾毒它灵、蟾毒灵以及华蟾毒精对照品由江苏省中医药研究院化学研究室提供，纯度>98%。

1.4 实验样品采集及鉴定

本研究所用蟾酥样品详见表1。所有样品均由江苏省中药研究院中药资源实验室钱士辉研究员鉴定。

表1 蟾酥样品信息

2 实验方法

2.1 色谱条件

利用高效液相色谱法，采用Waters MS C18色谱柱(250 mm×4.6mm，5 μm)；流动相：纯水和0.1% TFA乙腈溶液(梯度洗脱)；检测波长：296 nm；柱温：30 ℃；流速：1.0 mL·min-1，进样体积30 μL。

表2 纯水(A)-0.1% TFA乙腈(B)梯度洗脱

2.2 对照品溶液的制备

精密称取蟾毒它灵、蟾毒灵以及华蟾毒精对照品适量，分别用甲醇溶解得对照品溶液。精密吸取各对照品溶液1 mL，置10 mL量瓶中，甲醇稀释至刻度，摇匀，作为混合对照品溶液。

2.3 供试品溶液的制备

称取蟾酥细粉约0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加入50 mL甲醇称质量，加热回流提取1 h，放冷，加甲醇补足损失质量，摇匀，静置，上清液经0.45 μm微孔滤膜滤过，续滤液作为供试品溶液。

3 实验结果

3.1 方法学验证

3.1.1 精密度试验 取蟾酥供试品溶液(S1)，按2.1项下色谱条件连续进样6次，采用《中药色谱特征图谱相似度评价系统(2012版)》分析，以蟾毒灵为参照物，各共有峰相对保留时间RSD为0.096 0%～0.156 9%，相对峰面积RSD为0.840 6%～3.349 3%，均小于5%，符合指纹图谱检测要求。

3.1.2 稳定性试验 取蟾酥供试品溶液(S1)分别在0、2、4、12、24 h进行HPLC检测，以蟾毒灵为参照物，各共有峰的相对保留时间RSD值为0.263 6%～0.521 2%，相对峰面积RSD为2.414 0%～3.666 3%，表明供试液24 h内稳定。

3.1.3 重复性试验 取同一份蟾酥样品(S1)6份，按2.3项下方法制备样品溶液，按2.1项下色谱条件进样，采用《中药色谱特征图谱相似度评价系统(2012版)》分析，以蟾毒灵为参照物，各共有峰相对保留时间RSD为0.063 9%～0.439 0%，相对峰面积RSD为0.659 2%～4.952 0%，表明重复性良好。

3.2 不同产地蟾酥指纹图谱的建立与分析

3.2.1 HPLC指纹图谱测定 取不同产地10批蟾酥样品，按2.3项下方法制备供试品溶液，按2.1项下色谱条件测定，记录色谱图，结果见图1。

图1 蟾酥HPLC特征图(S1～S10)

3.2.2 对照指纹图谱的建立和共有峰的标定 将3.2.1条件下测定的色谱图数据导入相似度评价系统软件，以S1样品为参考图谱，时间窗宽度设为0.1 s，中位数法生成对照指纹图谱(图2)。蟾酥色谱指纹图谱以保留时间为44.079 6 min的9号峰作为参照峰S，对不同蟾酥药材的指纹图谱进行考察，共确定了10个共有峰，各共有峰面积见表3。

图2 蟾酥对照指纹图谱

表3 不同产地10批蟾酥药材共有峰面积

3.2.3 指纹图谱分析 由图1可知，蟾酥化学成分复杂，不同产地蟾酥化学组成基本相似，但含量差别较大，其共有峰面积RSD为4.22%～17.31%，在10 批次样品图中9号色谱峰(蟾毒灵)的分离度良好，所有样品共有且为蟾酥主要成分之一，因此将其确定为参照峰S。

3.2.4 相似度评价 使用《中药色谱特征图谱相似度评价系统软件(2012版)》对10批蟾酥药材色谱数据进行分析，以S1样品色谱图谱作为参照图谱，采用“中位数”法生成对照图谱，得到10批蟾酥药材特征图谱及相似度。结果10批不同产地蟾酥药材各色谱图相似度在0.920～0.967，表明10批药材相似度较好。

表4 不同产地蟾酥HPLC指纹图谱相似度计算结果

3.3 主成分分析

以蟾酥指纹图谱中标定的共有峰相对峰面积为变量，用SPSS17.0统计分析软件的因子分析进行主成分分析，以主成分的特征根及贡献率作为选择主成分的依据。主成分个数提取原则是取主成分对应的特征值大于1的前2个主成分，其累计贡献可以达到87.558%，即包括了大部分信息。其中第一主成分特征值为5.977，方差贡献率为59.769%；第二个主成分特征值为2.779，方差贡献率为27.789%。分别以第一、第二主成分来建立坐标系，得到所有样本PCA二维投影图(图4)，图中每一个点对应一个产地，10个产地可分为3类。

图3不同产地蟾酥药材PCA图

3.4 共有蜂的确认

本研究对10批蟾酥供试品溶液进行指纹图谱检测，确定了10个共有峰，并通过与对照品溶液比对，指认了其中3个色谱峰，分别为7号(蟾毒它灵)、9号(蟾毒灵)、10号(华蟾毒精)。结果见图4。

注：A.对照品；B.蟾酥样品；7.蟾毒它灵；9.蟾毒灵；10.华蟾毒精。图4 对照品和蟾酥样品HPLC图

4 结论

蟾酥为蟾蜍科动物中华蟾蜍BufobufogargarizansCantor或黑眶蟾蜍BufomelanostictusSchneider耳后腺和皮肤腺干燥分泌物。我国分布的蟾蜍科蟾蜍属动物品种众多，达十余种之多。分布最广的是中华大蟾蜍、花背蟾蜍BuforaddeiStrauch、黑眶蟾蜍和华西蟾蜍BufobufoAndrewsi。有研究表明，不同基原动物蟾酥成分差异显著。不同品种蟾蜍地理上交叉分布，加上捕捉者缺乏动物品种的准确辨识，易导致蟾酥品种混杂现象以及蟾酥药材质量的参差不齐，从而严重影响药材疗效及安全性，增加临床用药的安全风险。

本研究收集了10批不同产地的蟾酥药材，优化色谱条件，建立了蟾酥的HPLC指纹图谱。在10个共有峰中，有3个色谱峰经与对照品溶液比对，分别指认为蟾毒它灵、蟾毒灵、华蟾毒精。使用中药色谱指纹图谱相似度评价系统分析不同批次蟾酥样品的相似度为0.920～0.967，表明10批药材相似度较高。利用PCA方法对蟾酥药材的HPLC指纹图谱进行分析。聚类分析结果表明，10批样品可分成3类，样品S1、S2、S6、S7、S8、S10聚为一类，样品S3、S9聚为一类，样品S4、S5聚为一类，与相似度结果一致。

本研究建立了蟾酥的HPLC指纹图谱，共确定了10个共有蜂。中药指纹图谱可以全面反映蟾酥药材的化学成分以及各特征性有效成分间峰面积的相对比例，进而反映蟾酥药材的内在质量，为蟾酥药材判断真伪、评价优劣、考察稳定性和一致性提供依据。本实验采用指纹图谱结合PCA对不同产地蟾酥进行质量评价，所建立的测定方法快速准确，灵敏度高，可为蟾酥药材的质量控制和质量鉴别提供有效手段。