响应面优化超声波法提取竹叶黄酮

李 烨，朱志强，集 贤，张 平，邢亚阁，杨文宇，，李宣林

(1.天津农学院，天津 300384；2.国家农产品保鲜工程技术研究中心天津市农产品采后生理与贮藏保鲜重点实验室，天津 300384；3.宜宾西华大学研究院食品非热加工重点实验室食品非热加工工程技术研究中心，四川 宜宾 644004；4.西华大学食品与生物工程学院，四川 成都 610039)

竹子是禾本科多年生的常绿植物，具有非常高的使用价值，是当今世界最具有使用价值的植物之一[1-2]。竹叶是我国中医的传统药材。根据古代药典《本草求真》当中的记载：竹叶具有“凉心缓脾，清痰止渴，治疗上焦风邪烦热、咳逆顺促、呕秽吐血、一切中风惊痫等症”的特殊功效。究其原因，是因为竹叶中含有诸多微量元素如锰、锌、硒等，以及大量的黄酮类物质、酚酸、竹叶多糖、多种氨基酸以及芳香成分[3]。其中含量最多的黄酮类物质对人体大有裨益。竹叶黄酮的作用原理与银杏黄酮类似[3]。现代研究证明，竹叶黄酮类物质在抑菌、抗氧化、抗糖化、抗炎[4-5]改善人体血液循环、抗疲劳等方面都有明确的功效[6-8]。同时，竹叶黄酮类物质具有显著的抑制溃疡、解除局部痉挛以及降糖降血脂等作用[9]。黄酮类提取物已广泛应用在食品、药品等工业中[10]。

目前，竹叶黄酮类物质的提取方法主要是以乙醇[11-12]、丙酮[13]等作为溶剂进行热回流。当前竹叶黄酮的工业化提取依然使用热回流法，但该法存在耗能较大、耗时长，步骤繁琐、可能会出现二次污染、加大企业生产成本等缺点，同时，成品水溶性较差，会降低提取物的活性[14]。因此，基于超声波提取工艺时间短、能耗小、操作方法简单的优势，本次试验应用响应面优化法对新型超声波提取技术进行研究，最终得出实验室提取竹叶黄酮的最佳工艺参数，为车间中试和企业生产提供指导依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

样品：四川乐山产干燥后的淡竹叶。

药品：乙醇、芦丁、硝酸铝、亚硝酸钠、氢氧化钠等均购于国药集团化学试剂有限公司，均为分析纯。

仪器：UV-2450紫外分光光度计，岛津集团有限公司生产；FVSY-360超声波提取仪，北京同德创业科技有限公司生产。

1.2 检测方法

1.2.1 芦丁标准曲线的制作

芦丁标准曲线的制作采用以下步骤[15]：1)准确吸取芦丁标准溶液0、0.1、0.25、0.5、0.75、1 mL，分别相当于芦丁质量0、0.25、0.625、1.25、1.875、2.5 mg；2)将以上芦丁标准溶液分别移入10 mL刻度的加盖玻璃管中，加入30%乙醇至5 mL刻度处；3)在以上溶液中分别加入5%浓度亚硝酸钠溶液0.3 mL，摇匀后放置5 min。再分别加入10%浓度的硝酸铝溶液0.3 mL，摇匀后放置6 min。再分别加入浓度1.0 moL/L的氢氧化钠溶液4 mL。4)最后，用30%乙醇定容至10 mL刻度处，摇匀后放置10 min。5)以零管为空白，将制得的溶液倒入1 cm比色皿中，在510 nm的波长处测量不同浓度的芦丁溶液的吸光度。6)以吸光度为纵坐标、浓度为横坐标绘制标准曲线，最终得到回归方程，A=0.956 97C+0.059 21，式中：C为配制的黄酮标准溶液的质量浓度(mg/L)；A为测得黄酮标准溶液的吸光度值。R2=0.997 75，根据此方程，求算样品总黄酮的含量。

1.2.2 竹叶黄酮提取率的测定与计算

用移液抢吸取5 mL竹叶黄酮提取液，按照标准曲线制备的操作步骤，在510 nm波长处测量吸光度。通过下述公式计算竹叶黄酮的提取率[15]。

X=m1/5

式中：X为总黄酮含量(mg/mL)；m1为根据标准曲线计算得到的被测溶液中对应的芦丁含量(mg)； 5 为被测样品的取样量(mL)。

总黄酮提取率% =(m1×V×100)/m2

式中：m2为竹叶的质量(mg)；V为提取液的总体积(mL)。

1.3 样品处理

1.3.1 不同乙醇体积分数的试验

取4 g过20目筛竹叶粉末，采用200 kW[17]提取功率，料液比1:25，浸润30 min后，分别选取体积分数为40%、50%、60%、70%、80%的乙醇，超声提取60 min的条件下试验，分别测定吸光度并计算提取率。

1.3.2 不同料液比试验

取4 g过20目筛竹叶粉末，分别选取1:15、1:20、1:25、1:30、1:35共5个不同料液比，浸润30 min后，采用200 kW[17]提取功率，50%乙醇，超声提取60 min的条件下试验，分别测定吸光度并计算提取率。

1.3.3 不同提取时间试验

取4 g过20目筛竹叶粉末，50%乙醇，料液比1:25，浸润30 min后，采用200 kW[17]提取功率，分别选取10、20、30、40、50、60 min 6个不同提取时间的条件下试验，分别测定吸光度并计算提取率。

1.3.4 不同浸润时间试验

取4 g过20目筛竹叶粉末，料液比1:25，分别选取10、20、30、40、50、60 min 6个不同浸润时间，采用200 kW[17]提取功率，50%乙醇，超声提取40 min的条件下试验，分别测定吸光度并计算提取率。

1.3.5 不同提取功率试验

取4 g过20目筛竹叶粉末，分别选取50、100、150、200、250 kW 5个不同提取功率，50%乙醇，料液比1:25，浸润30 min后提取40 min的条件下试验，分别测定吸光度并计算提取率。

1.3.6 响应面试验设计

根据前期单因素试验的结果分析，乙醇体积分数、提取时间和提取功率对竹叶黄酮提取率的影响较大，而料液比和浸润时间对竹叶黄酮提取率的影响较小。以乙醇体积分数、提取时间、提取功率3个因素为自变量，选取乙醇体积分数50%、60%、70%作为影响因素乙醇体积分数的水平数值，选取提时间30、40、50 min作为影响因素提取时间的水平数值，选取提取功率150、200、250 kW作为影响因素提取功率的水平数值。利用Design Expert 8.0软件设计得出三因素三水平响应面试验方案，以竹叶黄酮提取率作为响应值，采用回归分析方程拟合自变量与响应值之间的函数关系，通过回归方程来优化工艺参数，预测响应值，获得最佳工艺条件[16]。试验因素水平编码见表1。

表1 响应面分析因素与水平编码

1.4 数据处理

通过3次重复试验，单因素试验结果的数据计算、绘制图表和分析采用Excel 2007及SPSS17.0软件，响应面试验设计、数据分析和绘制图表采用Design Expert软件。

2 结果与分析

2.1 单独因素对竹叶黄酮提取率的影响

2.1.1 不同乙醇体积分数对竹叶黄酮提取率的影响

由图1可知，乙醇体积分数在40%～80%时，竹叶黄酮提取率随着乙醇体积分数的逐渐增大而逐渐升高，在体积分数为50%时达到最高值，之后随着乙醇体积分数的增大竹叶黄酮的提取率逐步呈现下降的趋势。这可能是由于随乙醇体积分数的增大，提取液中除总黄酮外的其他物质的提取率也随之升高，从而影响总黄酮的提取，造成竹叶中总黄酮的提取率下降。由试验结果可知，乙醇体积分数为50%时竹叶黄酮的提取率最高。

图1 不同乙醇体积分数对竹叶黄酮提取率的影响

2.1.2 不同料液比对竹叶黄酮提取率的影响

由图2可知，在不同料液比情况下，竹叶黄酮的提取率随着料液比的变小而逐渐变大，在1:25料液比条件下达到最大值，之后随着料液比的继续变小而逐渐变小，但总体变化平稳。

图2 不同料液比对竹叶黄酮提取率的影响

2.1.3 不同提取时间对竹叶黄酮提取率的影响

由图3可知，在一定范围内，竹叶黄酮的提取率随着提取时间的增加而逐渐增大，在提取时间为40 min时提取率最高，之后随着提取时间的增大迅速下降，并趋于平缓。这可能是因为在超声提取时超声波会使提取液的温度升高，随着温度的上升提取液内的分子热运动会增加，从而有利于黄酮类物质向提取剂中运动，而随着提取时间的增加，提取液温度持续升高，可能会破坏黄酮的结构，使得提取率迅速下降。

图3 不同提取时间对竹叶黄酮提取率的影响

2.1.4 不同浸润时间对竹叶黄酮提取率的影响

由图4可知，在不同浸润时间下，竹叶黄酮提取率没有形成规律，在浸润时间30 min时竹叶黄酮提取率最高，但总体来看，提取率没有明显的变化。

2.1.5 不同提取功率对竹叶黄酮提取率的影响

由图5可知，在50～250 kW之间，竹叶黄酮的提取率随着提取功率的增大而升高，在提取功率达到200 kW时提取率最大，之后随着提取功率的增加而迅速下降。出现这种现象的原因可能是因为在提取过程中超声波的功率直接决定了机械振动的能量和空化作用的效果。超声波功率低时产生的能量较小，对竹叶的破壁效果不显著，导致提取率低；但随着超声波功率的增加，产生的机械作用逐渐增强，超过一定能量后反而会破坏竹叶中黄酮类物质的结构，同时会使空化趋于饱和，产生大量无用的气泡，从而增加散射衰减，降低空化强度，造成提取率迅速下降[17]。由此可知，最佳提取功率为200 kW。

2.2 采用响应面优化对黄酮提取率进行分析

2.2.1 响应面法优化分析试验结果

根据Box-Behnken的设计原理，分别以乙醇体积分数(50%、60%、70%)、提取时间(30、40、50)、提取功率(150、200、250 kW)设计三因素三水平试验，以黄酮提取率作为响应值进行优化。试验结果见表2。

图5 不同提取功率对竹叶黄酮提取率的影响

试验号因素ABC黄酮提取率/%1-1-114.2662-1113.56631005.4394-11-13.12150005.336600-13.44270005.38480014.13990-105.52310-1005.1351111-13.51212-1-1-13.852130005.269141-114.635150005.189160105.13171-1-13.862180005.387190005.2201114.32

2.2.2 数学模型的建立及分析

利用Design Expert软件对表2数据进行多元回归拟合，得到多元回归模型为：Y=5.28+0.18A-0.25B+0.31C+0.096AB+0.09AC+0.008BC+0.021A2+0.06B2-1.48C2为检验试验模型方程的有效性，对超声波法提取竹叶黄酮的提取率模型进行方差分析，分析结果见表3。

由表3可知，该模型方程的F值为253.75，P<0.000 1，极显著(P<0.01)，说明在描述各影响因素与影响值之间的关系，因变量和全体自变量之间建立的竹叶黄酮提取率的模拟回归方程极显著，误差极小，方法可靠。由表3还可以看出，失拟项P值为0.844 5>0.05，说明失拟项相对于纯误差是不显著的，表明模拟回归方程拟和情况良好，试验误差小，失拟项模型选择合适。同时，模型的决定系数R2=0.991 7，说明试验结果有99.17%受试验因素影响，模型模拟度良好，试验误差较小，因此该模型可以用来分析和预测竹叶黄酮提取工艺条件。

由表3可知，回归模型的一次项A、B对黄酮提取率的影响显著(P<0.05)，C对黄酮提取率的影响极显著(P<0.01)，二次方项C2对黄酮提取率的影响极显著。由F值可知，各影响因素的主次顺序为：C>B>A，即提取功率>提取时间>乙醇体积分数。

表3 回归模型方差分析结果

注：*表示影响显著(P<0.05)；**表示影响极显著(P<0.01)

2.2.3 响应面交互分析

图6—图8是各试验因子对响应值所构成的三维空间响应面-等高线图，采用Design Expert8.0软件绘制，每个曲面表示一个变量保持最佳水平时，另外2个变量间的相互作用。结合表3可知，AB交互作用P值为0.004 2，表示影响极显著，说明提取浓度与提取时间之间的交互作用对竹叶黄酮提取率存在极大影响；AC交互作用P值为0.005 9，表示影响极显著，说明提取浓度与提取功率之间的交互作用对竹叶黄酮提取率存在极大影响；BC交互作用P值为0.756 9，表示影响不显著，说明提取时间和提取功率之间的交互作用对黄酮提取率影响较小。

2.2.4 响应面优化与分析

以黄酮提取率为响应值的回归方程进行分析求解，最佳工艺参数为乙醇体积分数69.57%、提取时间30.57 min、超声功率193.26 kW，在该工艺条件下理论预测黄酮提取率为5.598 92%。未检验试验方法的可靠性，根据上述最佳参数并结合实际操作的可行性，将工艺条件修正为乙醇体积分数70%、提取时间30 min、提取功率190 kW。在以上工艺参数下进行3次平行试验，得到竹叶黄酮提取率的平均值为5.463%。与理论预测值相比较，相对误差为2.48%，误差较小，验证了竹叶黄酮模拟回归模型的有效性，确定可以使用响应面对竹叶黄酮提取率进行预测与分析。

图6 乙醇体积分数和提取时间的交互作用对竹叶黄酮提取率影响的响应面图

图7 乙醇体积分数和提取功率的交互作用对竹叶黄酮提取率影响的响应面图

图8 提取时间和提取功率的交互作用对竹叶黄酮提取率影响的响应面图

3 结论与讨论

本试验以四川产淡竹叶为原料，以乙醇体积分数、提取时间、提取功率作为影响因素，以黄酮提取率作为响应值，通过响应面法优化了竹叶黄酮超声波提取工艺，建立了竹叶黄酮提取率的模拟回归方程，经以上试验证明，该方程对试验结果拟合度良好，可以很好地预测竹叶黄酮的提取率，且影响提取率的因素作用：提取功率>提取时间>乙醇体积分数。优化得到的竹叶黄酮提取工艺条件为：乙醇体积分数70%，提取时间30 min，提取功率190 kW，该条件下竹叶黄酮提取率为5.463%，接近理论预测值。

黄酮提取工艺一直是国内外研究热点。竹叶黄酮因其食用安全、质量稳定和功效独特等特点被认为是一种较好的保健功能成分，并具有成本低、资源丰富等优势[18]。从竹叶中提取黄酮类化合物的方法有很多，如水煮法和有机溶剂提取法。以水作为溶剂提取，成本低但得率也低；有机溶剂提取法不仅工作强度大，溶剂回收率低，活性成分易破坏，而且对设备要求较高，得率较低[19]。作为近年来发展的一门新技术，超声波具有加热迅速、受热均匀、穿透力强、控制方便、传质速率和效果较好，且节约能量及不需要特殊分离步骤等优点[20]。利用超声波提取可增加有效成分的提取率，缩短提取时间，并且还可避免高温对提取成分的影响[21]。本研究在单因素试验基础上，采用响应面法优化竹叶黄酮超声波提取条件，为提高竹叶黄酮的提取率提供参考，为进一步综合开发利用竹类资源提供科学依据。