东方蜜蜂大肚病致病菌的分离鉴定及乳酸菌对其抑菌效果

汪思凡 曹振辉 潘洪彬

摘要：蜜蜂大肚病会引起蜂群的大面积死亡，造成巨大损失，通过无菌操作采集患大肚病的东方蜜蜂成年工蜂肠道，LB培养基分离培养致病菌，采用形态分析、生理生化检测、16S rDNA基因序列分析和人工攻毒试验对致病菌进行鉴定;应用滤纸片扩散法检测致病菌耐药性;采用琼脂孔扩散法研究从健康东方蜜蜂成年工蜂肠道中自主分离的瑞士乳杆菌和罗伊氏乳杆菌对致病菌的抑制作用。结果显示，从患大肚病的东方蜜蜂成年工蜂肠道中共分离得到12株菌株，均为革兰氏阴性杆菌，根据形态、生理生化和16S rDNA序列分析结果鉴定12株菌株均为黄杆菌;12株黄杆菌对氨苄青霉素、链霉素、万古霉素、卡那霉素、庆大霉素、新生霉素耐药，对阿莫西林敏感;饲喂黄杆菌KMD1和LPD2的东方蜜蜂成年工蜂腹部有明显膨胀，在饲喂6 d后对照组蜜蜂死亡率为25%，饲喂黄杆菌KMD1组蜜蜂死亡率为81%，饲喂黄杆菌LPD2组蜜蜂死亡率为73%;瑞士乳杆菌和罗伊氏乳杆菌均能显著抑制黄杆菌KMD1和LPD2增殖。鉴定出东方蜜蜂大肚病的致病菌为黄杆菌，东方蜜蜂肠道源乳酸菌对黄杆菌具有显著抑菌效果，试验结果对采用微生物制剂防治东方蜜蜂大肚病奠定了理论基础。

关键词：东方蜜蜂;致病菌;黄杆菌;耐药性;乳杆菌

中图分类号： S895  文献标志码： A  文章编号：1002-1302（2019）07-0189-04

蜜蜂是一种常见的有益昆虫，属于膜翅目细腰亚目针尾部蜜蜂总科蜜蜂科昆虫的统称，作为一种高度社会性昆虫，其传染性疾病产生会呈现爆发性发生和混合性发生的特点，一旦发病会表现出流行速度快、发病区域广、致病率高的特点，对蜂群威胁极大[1]。

蜜蜂大肚子病是一种传染性极强的蜜蜂疾病，在几周内可蔓延到全群，患病严重的蜂群，死蜂会堆积满整个箱底。该病不分时节均可发生，由于受到外界恶劣环境的影响，蜜蜂不能出巢，无法排泄飞翔，导致其后肠积粪膨胀，加上粉蜜源断绝，仅靠人工饲养，营养往往不足，抵抗力减弱，则会易患此病，患病蜜蜂往往行动呆滞，对外界刺激反应迟钝，较严重者会完全丧失飞行能力，在麻痹中死亡。该病在蜂群中发生不仅严重影响了整个蜂群的健康，还对蜂群的研究造成了巨大的损失[2]，因此该研究主要针对引起蜜蜂大肚子病的病原菌进行分离鉴定，以期为该病诊断、预防和治疗提供一定的理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品采集 2017年5月分别从云南农业大学养蜂场（云南昆明）与罗平养蜂场（云南罗平）随机各取12只东方蜜蜂成年工蜂，通过无菌操作分别取出其肠道。

1.1.2 乳酸菌菌株 瑞士乳杆菌（Lactobacillus helveticus）和罗伊氏乳杆菌（L. reuteri），由笔者所在课题组从健康东方蜜蜂肠道内自主分离，GenBank登录号为MG574870和MG574871。

1.1.3 主要试剂 LB培养基，革兰氏染色剂，葡萄糖、鼠李糖、蔗糖、麦芽糖、半乳糖、乳糖、甘露醇、甘露糖，药敏试纸，购于英国Oxoid公司;DNA快速抽提试剂盒，购自生工生物工程（上海）股份有限公司;Taq DNA聚合酶，购自上海Promega生物产品有限公司;DL2000 DNA marker，購自TaKaRa公司;溶菌酶，购自Sigama公司;16S rDNA引物，购自生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 东方蜜蜂大肚病致病菌的分离 在无菌条件下取出蜜蜂肠道，转移入1.5 mL离心管中，匀浆后接入LB液体培养基中37 ℃培养箱培养，富集后将培养液梯度稀释接种于LB琼脂培养基上，37 ℃培养后从平板中挑取每个样品中菌落形态不同的单菌落，纯化3次后于-80 ℃冰箱冻存备用[3]。

1.2.2 东方蜜蜂大肚病致病菌的鉴定

1.2.2.1 生理生化鉴定 将分离所得菌株分别通过革兰氏染色试验、接触酶测定试验、葡萄糖产酸产气试验、糖发酵试验、硫化氢试验、硝酸银试验[4]对分离所得菌株进行鉴定。

1.2.2.2 分子生物学鉴定 按照生工生物工程（上海）股份有限公司DNA快速抽提试剂盒（SK8225）说明书对菌株进行基因DNA的提取，以提取DNA为模板，使用通用引物27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）和1 492R（5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′）进行PCR扩增，PCR扩增体系为：2×Ex Taq buffer 25 μL，10 μmol/L上下游引物各1 μL，DNA模板 2 μL，ddH2O2 1 μL，共50 μL体系;PCR扩增条件为：95 ℃ 预变性4 min;94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1.5 min，30 个循环;72 ℃最后延伸 10 min，4 ℃保存。将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检验，检验扩增成功的产物进行测序，测定序列后分析比对并通过ClustalX 2.0和Mega 4.0软件构建系统发育树对分离所得菌株进行鉴定。

1.2.3 抗生素敏感性试验 采用滤纸片扩散法，取分离株菌悬液0.5 mL加入10 mL温度约50 ℃的LB固体培养基中迅速混匀，倒入已铺底的平皿中，待培养基凝固后，贴放标准药敏纸片，测量抑菌圈直径[5]。试验用抗生素的种类、药敏纸片含药量及抑菌圈直径判断标准见表1。

1.2.4 人工感染试验

1.2.4.1 生长曲线的建立 将黄杆菌接种至LB肉汤培养基中，37 ℃培养，活化3次，用肉汤培养基稀释菌液至D600 nm值在0.2～0.8之间，在紫外分光光度计上测量D600 nm，以稀释后D600 nm值在0.2～0.8之间的菌液进行梯度稀释，稀释后的菌液均匀地加到琼脂平板上，37 ℃培养后计数。

1.2.4.2 攻毒 从云南农业大学养蜂场捉取300只东方蜜蜂成年工蜂，平均分为3组，分别饲养在3个自制培养箱中，试验Ⅰ组为对照组，饲喂普通无菌糖水，试验Ⅱ组和Ⅲ组分别饲喂添加有108 CFU/mL黄杆菌的糖水，试验过程均保证充足糖、水的供应[6]。

1.2.5 乳酸菌对黄杆菌的体外抑制作用 瑞士乳杆菌和罗伊氏乳杆菌37 ℃厌氧过夜培养，离心（10 000 r/min，4 ℃，30 min）收集上清液，调节pH值至6.2备用。采用琼脂打孔扩散法，将黄杆菌37 ℃过夜培养后，吸取0.02 mL菌液于 20 mL 温度50 ℃的TSA中剧烈混合后倾注平板，将中和的乳酸菌培养上清液加入80 mm琼脂孔内，37 ℃培养24 h后，测量抑菌圈直径（mm），并与参考菌株鼠李糖乳杆菌（L. rhamnosus）GG比较[7]。

2 结果与分析

2.1 东方蜜蜂大肚病致病菌的分离

在无菌条件下取出蜜蜂肠道，转移入1.5 mL离心管中，匀浆后接入LB培养基中，通过纯化培养共分离得到12株分离菌，（编号为KMD1、KMD2、KMD3、KMD4、KMD5、KMD6、KMD7、KMD8、KMD9、LPD1、LPD2、LPD3），分离纯化后的菌落形态及菌体形态的观察情况见表2。

2.2 东方蜜蜂大肚病致病菌的分离

2.2.1 生理生化鉴定 将分离得到的12株分离菌进行革兰氏染色、接触酶、葡萄糖产酸产气、糖类发酵、硫化氢、硝酸银的生理生化试验，由表3、表4可知，对照《伯杰氏细菌手册》，筛选分离出的12株菌生理生化特性符合黄杆菌的特征。

2.2.2 分子生物学鉴定

2.2.2.1 16S rDNA序列的同源性分析 将测序得到12株分离菌的16S rDNA序列利用NCBI的BLAST进行同源性比对，12株分离菌株的比对结果显示为黄杆菌（表5）。

2.2.2.2 系统发育分析 从NCBI的Genbank核酸数据库中随机取已收录的黄杆菌16S rDNA序列，运用Mage 5.0和ClustalX 1.83构建系统发育树，由图1可知，所有分离菌与黄杆菌属中的F. frigidimaris亲缘性最近，结合 16S rDNA 序列同源性分析结果，表明从患大肚病的东方蜜蜂的肠道中分离得到的12株分离菌均为黄杆菌。

2.2.3 人工攻毒试验

2.2.3.1 生长曲线的建立 选择KMD1、LPD2 2株黄杆菌对成年东方工蜂进行攻毒试验，分别建立KMD1、LPD2 2株黄杆菌的生长曲线，由图2、图3可知，黄杆菌KMD1的D值（y）与菌落数（x）的线性关系为y=（21.969x+1.015 1）×108，r2为 0.990 1;黄杆菌LPD2的D值（y）与菌落数（x）的线性关系为y=（13.092x+1.755 7）×108，r2为0.991 8。

2.2.3.2 蜜蜂死亡率 饲喂KMD1组为试验Ⅱ组，饲喂LPD2组为试验Ⅲ组，由图4可知，饲喂6 d后试验Ⅱ组和Ⅲ组相较对照组死亡率均显著上升（P<0.05），对照组蜜蜂死亡率为25%，试验Ⅱ组蜜蜂死亡率为81%，试验Ⅲ组蜜蜂死亡率为73%。与对照组比较，黄杆菌攻毒组蜜蜂腹部有明显膨胀、行动迟缓，多在箱底爬行，使用小鑷子挤压蜜蜂尾部，会排出粪便，嗅其味臭。

2.3 抗生素敏感性试验

对12株黄杆菌采用滤纸片扩散法[5]进行抗生素敏感试验，抗生素敏感性的判定参照WHO提供的CLSI最新版的标准进行。由表6可知，12株黄杆菌对氨苄青霉素、链霉素、万古霉素、卡那霉素、庆大霉素、新生霉素基本耐药，对阿莫西林敏感。

2.4 乳酸菌对黄杆菌的体外抑制作用

由表7可知，东方蜜蜂肠道源乳酸菌瑞士乳杆菌和罗伊氏乳杆菌的培养上清液对12株黄杆菌具有显著抑制作用，抑菌活性优于或与参考菌株LGG相当。

3 讨论与结论

本研究从东方蜜蜂成年工蜂肠道中分离出了蜜蜂大肚病的致病菌，通过生理生化分析、分子生物学鉴定和攻毒试验，鉴定其为黄杆菌科黄杆菌属菌株。抗生素敏感性试验测定了致病菌对各种抗生素的敏感程度，确定了12株黄杆菌对氨苄青霉素、链霉素、万古霉素、卡那霉素、庆大霉素、新生霉素基本耐药，对阿莫西林敏感。因此，在治疗蜜蜂大肚病的过程中，可以适量使用阿莫西林。Decostere等报道，从热带鱼中分离出的柱状黄杆菌对新生霉素耐药[8]，与本试验结果较一致。但陈昌福等报道，从湖北各地分离的柱状黄杆菌对大多数供试抗生素均高度敏感[9];黄文芳等亦报道其分离的柱状黄杆对多种抗生素、呋喃类敏感，共27种药物仅对磺胺噻唑不敏感，皆与本研究结果差异较大[10]。分析结果可能由于不同宿主、不同地域、不同分离菌株间的药物耐药性具有一定的差异，亦可能是由于抗生素滥用致使细菌具有了耐药机制，亦或是长期使用小剂量抗生素，不仅未达到杀菌目的，反而逐步诱发了细菌的耐药性。因此，在规模化蜜蜂养殖过程中，对于治疗蜜蜂疾病，一定要做到查明病因，科学化、合理化地使用抗生素，同时在药物的使用上也须做到联合使用、交叉使用的方法，不仅可以充分发挥药物的疗效，也可以避免细菌长期与一种药物接触，产生耐药机制[11]。

乳酸菌作为一种益生菌其在抑制肠道致病菌的方面已有了广泛研究，乳酸菌能产生有机酸、过氧化氢和细菌素，具有抑菌作用，且其还可以通过与致病菌竞争肠上皮细胞黏附位点，达到抑制致病菌的作用[12]。本研究采用从健康东方蜜蜂肠道内分离出的2株乳酸菌（瑞士乳杆菌和罗伊氏乳杆菌），首次研究了其对蜜蜂大肚病致病菌黄杆菌的抑制作用，结果显示这2株乳酸菌均具有显著抗菌活性，为采用微生物制剂防治蜜蜂疾病、降低抗生素依赖性提供了理论依据。

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