基于整合药理学的玉液汤治疗2型糖尿病的作用机制

陈澈 乔海琦 周晟

(宁夏医科大学 1中医学院，宁夏 银川 750004；2教务处教务科；3青岛如一软件有限公司)

糖尿病是一种慢性代谢紊乱性疾病，根据国际糖尿病联盟公布的最新数字，全球有约4.25亿成年人患有糖尿病，2045年可能攀升至6.29亿〔1〕。2型糖尿病作为糖尿病最常见的类型，是由多种基因遗传及环境因素综合导致的一组以糖代谢紊乱为主要表现的临床综合征，具有多种程度的胰岛素抵抗和胰岛β细胞功能异常〔2～4〕。研究表明2型糖尿病的作用机制涉及体内物质与能量的代谢、信号转导等方面，且与多个系统密切相关〔5〕。

中医药治疗2型糖尿病具有独到的优势，可以通过调节人体脏腑功能、改善身体内环境从而达到控制血糖、延缓并发症的目的。玉液汤是治疗消渴病的经典名方，出自张锡纯〔6〕《医学衷中参西录》，由黄芪、葛根、鸡内金、知母、五味子、山药、天花粉组成，具有补脾固肾、益气养阴、生津止渴之功效。本课题组前期研究结果显示〔7〕，玉液汤是临床治疗2型糖尿病的常用方剂，且其组成药物多为中药治疗2型糖尿病的核心用药。

以“玉液汤”为主题词检索中国知网，可看出玉液汤的研究主要集中在临床应用研究、文献研究及相关动物实验(图1)，但从系统和整体角度对其降糖机制探讨的研究尚有不足，其治疗2型糖尿病的机制和关键环节点也尚不清楚。由于玉液汤组成药物众多，有效成分复杂，传统的还原论方法研究并不能很好揭示多种生物分子网络相互作用紊乱而引起的复杂疾病作用机制〔8〕。整合药理学是将整体与局部、宏观与微观、药物体内吸收、分布、代谢和排泄过程与活性评价、计算与实验相互结合，从多层次、多角度来研究多成分药物与机体相互作用及其整合规律和作用机制的一门学科，已成为解析中药复方体系之有效方法〔9〕。本文应用整合药理学，尝试从整体和系统的角度探究玉液汤治疗2型糖尿病的药理机制和关键作用环节。

图1 玉液汤与2型糖尿病相关文献可视化分析

1 材料与方法

1.1玉液汤化学成分筛选 以“葛根”、“黄芪”、“鸡内金”、“知母”、“山药”、“天花粉”和“五味子”为关键词在中药整合药理学V1.0版本中进行中药化学成分的收集〔10〕。该平台依据2015年版《中国药典》、文献信息及开源中药数据库，收录了400余味常用中药所含的13万余个化合物成分信息以供检索。

1.2中药成分靶点预测 对药物二维结构进行相似性搜索，即采用中药分子指纹，利用OpenBabel开源软件提取化学指纹特征，并采用谷本系数定义的相似度计量方法，通过与美国食品药品监督管理局上市药物进行相似性打分(score>0.8)获取中药成分作用靶标。

1.3疾病靶标预测 在中药整合药理学平台V1.0中以“2型糖尿病”为关键词检索疾病靶点，该平台整合了Drugbank数据库、人类孟德尔遗传数据库(OMIM)、人类表型本体数据库(HPO)和药物靶标数据库(TTD)等资源，可对疾病相关基因和蛋白质信息进行检索。

1.4核心靶点筛选及网络构建 基于上述预测和筛选的中药靶标和疾病靶标，建立“中药靶标-疾病靶标”相互作用网络。以节点度2倍的中位数为卡值，选取该网络中的核心节点。此外，对网络进行拓扑性质分析，将同时满足“节点度”、“节点紧密度”和“节点介度”的中位数为卡值的节点选取，构建玉液汤治疗2型糖尿病的核心靶点网络。其中连接度〔11〕为顶点关联边的数目，即该节点的邻居数，该值越大，表示此节点越重要；紧密度〔12〕是指一个节点通过网络到达另一个节点难易程度的指标，节点紧密度越高，则与其他节点的关系越近；介度〔13〕指在网络中通过该节点的最短路径数目，反映了节点在网络中的枢纽性，该值越大，说明这个节点的枢纽性越强。

1.5关键靶标功能预测与富集分析 针对核心靶标，同时查询基因本体数据库(GO)及京都基因与基因组百科全书数据库(KEGG)，对关键靶标进行基因功能分析和通路富集分析。根据P值大小，选取排名前30的通路，通过可视化方法构建“中药-成分-靶标-通路”多层网络图，进一步了解相关靶标功能，预测并解析玉液汤治疗2型糖尿病的机制。

2 结 果

2.1玉液汤中所含成分及其预测靶标概况 玉液汤中7味中药中共得到273个化学成分，其中葛根33个、黄芪29个、鸡内金2个、山药61个、天花粉9个、五味子98个、知母41个。上述成分共预测到潜在作用靶标1 971个，其中葛根131个、黄芪230个、鸡内金27个、山药1 091个、天花粉208个、五味子70个、知母214个。

2.2玉液汤中单味药材之间的共有靶标情况 从表1中可以看出，除了每味中药各自预测到的潜在靶标，7味中药还存在共用靶标，即不同的中药具有相同的作用靶标。其中黄芪-山药、葛根-山药、葛根-天花粉、天花粉-山药、黄芪-知母、山药-知母、鸡内金-山药、鸡内金-天花粉的共同作用靶标均大于其自身作用靶标的一半以上，提示玉液汤治疗2型糖尿病具有多成分-靶标、相互协同的治疗特点。

表1 玉液汤单味中药间共有靶标(靶标)

2.3玉液汤治疗2型糖尿病的关键靶标分析 对药物靶标和疾病靶标构建相互作用网络，共预测到核心靶标350个，其中潜在靶标148个，疾病已知靶标17个，药物靶标与疾病共有靶标4个，其他靶标181个。将上述靶标进行“节点连接度”、“节点紧密度”和“节点介度”的网络拓扑特征参数分析，根据网络参数值，选择排名前10的网络靶标，依次为磷脂酶Cδ(PLCD)1、葡萄糖激酶(GCK)、G蛋白亚基β1(GNB1)、核苷酸外焦磷酸酶/磷酸二酯酶(ENPP)1、过氧化物酶体肉毒碱O-辛酰基转移酶(CROT)、1型腺苷酸环化酶(AOCY1)、钠/钾转运ATP酶亚基α-1(ATP1A1)、5′-AMP-活化蛋白激酶催化亚基α-1(PRKAA1)、细胞溶质嘌呤5′-核苷酸酶(NT5C2)、DNA聚合酶epsilon亚基(POLE)4，其中PLCD1、GCK是连接度、紧密度最大的节点。见表2。查阅文献发现PLCD1可参与脂质降解与脂质代谢，是维持代谢稳态的关键酶〔14〕。而GCK在糖代谢和调节胰岛素分泌过程中发挥重要作用，可促进葡萄糖摄取与转化〔15〕。

表2 玉液汤治疗2型糖尿病的关键靶标名称及其相关网络拓扑特征参数值

2.4玉液汤治疗2型糖尿病的核心网络构建 在上述结果的基础上，以“节点度”、“节点紧密度”和“节点介度”的中位数为卡值，选取同时满足3个卡值的节点，并根据连接度的值显示前100个核心靶点，构建玉液汤治疗2型糖尿病的候选靶标网络，图中节点的大小与连接度值呈正比关系，如图2所示。图中红色代表药物潜在作用靶标，共66个；黄色代表已知疾病靶标，共7个；绿色代表药物与疾病共同靶标，共2个；灰色代表其他靶标，共25个。丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶2A催化亚基β(PPP2CB)和蛋白激酶Cβ(PRKCB)是药物与疾病的共有靶标，PPP2CB可参与信号传导与糖原代谢，从而调节血糖。PRKCB涉及多种细胞过程，参与胰岛素信号传导及脂肪细胞中葡萄糖转运，在糖尿病发病中起重要作用〔16〕。此外，在图中可以发现，药物成分作用的靶标不仅可以直接作用于疾病靶点，还可以通过间接联系而发生作用关系。如有些红色、黄色、绿色的节点必须通过灰色节点作为枢纽才能建立连接，起到过渡的作用，亦是药物干预疾病的关键环节。

图2 玉液汤治疗2型糖尿病的候选靶标网络示意图

2.5核心靶标的功能分析和通路富集结果 通过对关键靶标进行基因功能分析，根据P值的大小列举前20条功能信息，可以看出这些关键靶标涉及细胞质、细胞质膜、线粒体、信号转导、腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)结合、PRK活性、蛋白结合、酶结合、血小板活化、肽酰丝氨酸磷酸化、蛋白磷酸化、蛋白合成、蛋白质丝氨酸/苏氨酸激酶活性、凋亡过程的负调控等多个条目(表3)。推测2型糖尿病与细胞转导、能量代谢及生物合成等多个方面因素相关。进一步分析富集通路结果，得出20条关键通路，涉及多方面因素(表4)。不仅包括嘌呤代谢、核苷酸代谢等能量相关通路，神经系统、内分泌系统、循环系统等方面。此外，还涉及谷氨酸能突触、细胞生长与死亡、雌激素信号转导通路、促性腺激素释放激素信号转导通路、趋化因子信号转导通路、ErbB信号通路等作用环节。与此同时，还发现其与环境适应、长期压力、胶质瘤、前列腺癌等方面也有相关关系。

表3 玉液汤治疗2型糖尿病关键靶标具有的功能信息列表

表4 玉液汤治疗2型糖尿病关键靶标所参与的通路信息列表

2.6玉液汤治疗2型糖尿病“核心成分-关键靶标-主要通路”多维网络关系图 根据上述研究结果，构建了玉液汤“中药-成分-靶点-作用通路”可视化网络图(图3)。

绿色代表中药，紫色代表成分，蓝色代表关键靶标，红色代表通路图3 中药方剂治疗疾病“核心成分-关键靶标-主要通路”多维网络关系图

从图中可以看出，玉液汤中共有86个活性成分，其中山药含有19个、黄芪含有21个、知母含有28个、葛根含有7个、天花粉含有7个、鸡内金含有1个、五味子含有6个，其中黄芪-知母、山药-黄芪-天花粉各有1个相同成分。这些成分共同作用于101个靶点及30条主要通路。除了涉及核苷酸代谢、神经系统、内分泌系统、循环系统细胞生长与死亡、雌激素信号转导通路等多个环节点，还与Rap1信号通路、胆碱能突触、Ras信号通路、钙信号通路、甲状腺激素信号通路等有关。

3 讨 论

2型糖尿病属于中医“消渴”的范畴，中医认为消渴多由于先天禀赋不足，或饮食不节、损伤脾胃、积热内蕴、化燥伤津，或劳欲所伤、肾阴亏损、虚火内生所致，其病机主要在于阴津亏损，燥热偏盛，治疗上往往采取健脾益气、清热润燥、固肾养阴等方法。2型糖尿病相关研究结果发现，细胞质膜、线粒体、信号转导、凋亡过程的负调控、氨基酸代谢、趋化因子信号转导通路、ErbB信号通路等相关代谢通路、信号通路及神经系统、内分泌系统、循环系统等方面均与2型糖尿病密切相关〔17～19〕。临床研究显示，玉液汤不仅可以改善临床患者血糖，而且能降低三酰甘油、总胆固醇，并能发挥抗氧化、修复胰岛β细胞作用〔17～19〕。

本研究的网络药理学预测结果显示，玉液汤在治疗2型糖尿病的过程中，可作用于上文多个关键环节点，且具有多成分多靶点的复杂作用机制。从本研究构建的“玉液汤成分靶标-2型糖尿病靶标”的分子生物网络及玉液汤“中药-成分-靶标-通路网络”中可看出，PLCD1、GNB1、GCK及ENPP1是网络中较为重要的节点，PPP2CB和PRKCB是药物和疾病共同靶点。相关研究文献显示〔20〕，GCK及ENPP1与胰岛素抵抗显著相关，能抑制胰岛素作用，导致葡萄糖转运信号及其在骨骼肌和脂肪中的利用率减少，当减少GCK及ENPP1的表达，则可改善胰岛素抵抗，而PLCD1、GCK、PPP2CB和PRKCB亦可通过调节糖脂代谢起到治疗作用〔21，22〕。

对本研究构建的网络进行进一步分析可发现，五味子中有4个成分可以同时作用于PPP2CB和PRKCB，有2个成分能同时作用于GNB1；山药中有2个成分能作用于PLCD1和GCK及ENPP1；黄芪和山药可以共同作用于GCK。研究显示〔23～25〕，五味子具有抗氧化和促进小鼠肝糖原合成的作用；黄芪能促进血浆胰岛素和C肽分泌，且可以保护胰岛功能和调节免疫功能紊乱；山药能起到清除体内氧自由基、减少过氧化脂质合成的作用，且能提高葡萄糖耐受力〔26，27〕。结合本研究结果可以推测，玉液汤中的五味子、黄芪和山药的相关成分或对2型糖尿病的治疗起到关键作用，且玉液汤中的多种化合物之间协同交叉作用于人体的多种靶标和通路，通过参与胰岛素信号传导、脂肪细胞中葡萄糖转运、胰岛素抵抗等多个过程产生了一个综合的降糖机制。