ε-聚赖氨酸和L-抗坏血酸处理对鲜切菠菜品质的影响

郁 杰，谢 晶,3,4,*

（1.上海海洋大学食品学院，上海 201306；2.上海冷链装备性能与节能评价专业技术服务平台，上海 201306；3.农业农村部冷库及制冷设备质量监督检验测试中心（上海），上海 201306；4.食品科学与工程国家级实验教学示范中心（上海海洋大学），上海 201306）

菠菜（Spinacia oleraceaL.）是一种绿叶蔬菜，由中等大小的叶片组成，叶片厚实、颜色鲜绿，叶片和茎都可食用，低热量且富含VA、VC以及铁等微量元素，深受国内外消费者青睐。鲜切蔬菜作为一种蔬菜商品化新形式逐渐进入人们视野，通常将蔬菜鲜切后置于4 ℃下待售[1]。但由于菠菜叶片面积较大、气孔分布广，极易受到腐败菌侵染，一旦微生物进入气孔内部很难被清除[2]，且鲜切后的菠菜汁液流失、愈伤呼吸剧烈[3]，不耐贮藏；因此急需探寻适宜的保鲜方式延长鲜切菠菜的货架期。

ε-聚赖氨酸（ε-polylysine，ε-PL）结构上由多个赖氨酸残基聚合而成，是一种主要从链霉菌属的代谢产物中分离提取得到的功能性多肽，属于天然防腐剂，具有广谱抑菌、热稳定性好等特点，被摄入后可降解成赖氨酸被人体吸收。ε-PL已于2003年10月被美国食品药品监督管理局批准为安全食品保鲜剂[4]，我国GB 2760—2014《食品安全国家标准 食品添加剂使用标准》[5]已规定可将ε-PL用于蔬果保鲜，且已有将其用于柑橘[6]、鲜切竹笋[7]等的保鲜研究。通常ε-PL可与有机酸等物质联合使用，具有明显的协同增效作用，已有文献证明：抗坏血酸盐与ε-PL复合的保鲜剂处理鲜切苹果[8]、鲜切甘薯[9]可有效防止褐变，具有优异的护色性能，有利于维持品质。但近年来，ε-PL应用于水果[10]、水产品[11]、肉制品[12]的保鲜研究较多，而对叶类蔬菜的保鲜研究较少；因此本实验探究ε-PL和L-抗坏血酸（L-ascorbic acid，AA）保鲜鲜切菠菜的可行性，以弥补该领域的不足。

本实验通过抑菌圈实验研究ε-PL和AA的抑菌效果，而后结合色泽、腐败菌数量、水分变化、丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活力等指标，综合探讨ε-PL和AA保鲜鲜切菠菜的效果，为延长鲜切菠菜的货架期提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

菠菜为大棚种植、有刺种，于10月份采摘，采摘时温度约15 ℃，相对湿度约为80%，采摘后20 min内由农户直接送至实验室。所选菠菜大小均一、色泽鲜绿、清洁、无明显缺陷、无病虫毒害

AA 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；平板计数琼脂培养基（plate count agar，PCA）、营养琼脂培养基（nutrient agar，NA）、脑心浸出液肉汤（brain heart infusion broth，BHI）、假单胞菌琼脂培养基（pseudomonas cfc selective agar base，CFC）、肠杆菌科琼脂培养基（violet red bile dextrose agar，VRBDA）、甘露醇氯化钠琼脂培养基（mannitol salt agar，MSA）岛海博生物技术有限公司；ε-PL（相对分子质量小于5 000）、草酸、氯化钠、丙酮、碳酸钙粉、2,6-二氯靛酚盐、石英砂、2-硫代巴比妥酸（分析纯） 国药集团化学试剂有限公司；SOD试剂盒 南京建成生物科技有限公司；三氯乙酸（纯度＞99%） 上海生工生物工程有限公司。

1.2 仪器与设备

H-2050R-1型高速冷冻离心机 长沙湘仪离心机有限公司；HVE-50型高温高压灭菌锅 日本Hirayama制造有限公司；WFZ UV-2100型紫外-可见分光光度计 上海龙尼柯仪器有限公司；VS-1300L-U超净工作台 上海康福特环境科技有限公司；CR-400型色差计日本Konica Minolta公司；PQ 001型台式脉冲核磁共振（nuclear magnetic resonance，NMR）分析仪 上海纽迈电子科技有限公司；BCD-252MHV型冰箱 苏州三星电子有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菠菜的鲜切处理及分组

将样品用自来水冲洗，除去表面泥污，晾干后用已灭菌的不锈钢菜刀距菠菜叶片茎部约4 cm处进行鲜切。初筛时，将实验分为对照组（去离子水）、单一处理组（0.005、0.05、0.5 g/Lε-PL溶液和1、10、100 g/L AA溶液，溶液均由去离子水配制，共6 组）和复合处理组（单一处理组的各质量浓度混合液，共9 组），具体各组溶液配方见表1。将鲜切菠菜浸泡于上述保鲜液，30 s后取出沥干，并通风晾干、分装放入无菌托盘（70 g/盘），并用无菌聚乙烯保鲜膜包好，置于4 ℃下贮藏。

表1 单一及复合保鲜液实验组Table 1 Single and combined preservative treatments

根据鲜切菠菜的货架期结果初步筛选出各个处理组的最优质量浓度，进行下一步的指标测定。鲜切菠菜的水分迁移变化分别在第0、6、12天时测定，其余指标隔天测定一次。其中初筛时货架期的确定以12 名普通消费对鲜切菠菜气味、色泽、质地、滋味进行评价，标准参照Paillart等[13]的方法。

1.3.2 保鲜剂抑菌性能评估

1.3.2.1 抑菌圈实验

金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens）、成团泛菌（Pantoea agglomerans）均从鲜切菠菜中提取并分离纯化。以上菌种通过观察细菌形态、菌落形状、菌落颜色和进行H2O2酶实验、氧化酶实验、明胶水解、吲哚实验、葡萄糖利用、V-P实验、O-F实验后，所得镜检和生理生化实验结果与《伯杰细菌鉴定手册》、鲜切菜品的鉴定图谱[14]进行比对后验证。参照石超等[15]的方法，采用牛津杯法测定金黄色葡萄球菌、荧光假单胞菌、成团泛菌的抑菌圈直径。

1.3.2.2 菌落总数及优势腐败菌的计数

总菌及优势腐败菌的培养见表2，并参照GB 4789.2—2016《食品安全国家标准 菌落总数测定》[16]的方法计菌落总数。

表2 各种微生物的培养条件Table 2 Culture conditions for various microorganisms

1.3.3 感官评定

挑选12 名经过培训的评定人员进行感官评定，每实验组随机取样评定3 次。标准参照Paillart等[13]的方法，对叶片的整体颜色及表观、消费者的接受度、叶片萎焉程度（在白色背景下观察）进行评价。分数越高代表品质越好，隔天评定一次，每项评定满分为10 分，各项总分之和取平均数，得到最终的总分。当总分低于5 分时，表明失去商品价值。

1.3.4 理化指标的测定

1.3.4.1 质量损失率的测定

参照金文斌等[17]方法测定，根据式（1）计算质量损失率。

式中：m0表示鲜切菠菜的初始质量/g；mt表示贮藏时间t时鲜切菠菜的质量/g。

1.3.4.2 色差的测定

色差参考Hasperué等[18]的方法并稍作修改。在随机条件下，从不同处理组中取出菠菜样品，在用白色校正板校准色差计后，测定各个叶片表面色度，记录色差指标L*值（亮度）、a*值（红绿程度）和b*值（黄蓝程度）。当a*＞0、b*＞0时按式（2）计算色度角h/（°）；当a*＜0、b*＞0时按式（3）计算h。

1.3.4.3 叶绿素含量的测定

参照NY/T 3082—2017《水果、蔬菜及其制品中叶绿素含量的测定 分光光度法》[19]，使用分光光度法测定叶绿素含量，具体计算见式（4）。

式中：VT表示提取液的总体积/mL；n表示提取液的稀释倍数；m表示鲜切菠菜质量/g。

1.3.4.4 水分分布的测定

参照杨冲等[20]的实验方法进行低场核磁共振（low field-NMR，LF-NMR）横向弛豫时间T2谱图的测定。各个样品取样要求位置一致，并剪成4.0 cm×3.0 cm尺寸的长方形。

1.3.4.5 丙二醛含量的测定

参照乔永祥等[21]的方法测定MDA含量。称取1.0 g样品，加入5.0 mL 100 g/L三氯乙酸溶液，研磨匀浆后，于4 ℃、10 000×g离心20 min，得上清液，取2.0 mL上清液加入2.0 mL、0.67 g/100 mL硫代巴比妥酸溶液，混合后在沸水浴中煮沸20 min，取出流水冷却后再在10 000×g条件下离心一次，分别取4 mL上清液在450、532、600 nm波长处测定吸光度，重复3 次。

1.3.4.6 SOD活力的测定

参照SOD测试盒中的羟胺法，上清液的制备：取1 g样品叶片放入9 mL冰冷的磷酸盐缓冲液（pH 7.4）中，用匀浆机以15 000 r/min在冰浴条件下上下研磨制成匀浆液，在5 000×g的条件下离心10 min，取上清液。在测定管中分别加入75 mmol/L磷酸盐缓冲液（pH 7.8）1 mL、待测样品的上清液1 mL、0.1 mol/L盐酸羟胺溶液0.1 mL、75 mmol/L黄嘌呤溶液0.1 mL和0.037 U/L黄嘌呤氧化酶0.1 mL，用漩涡混匀器充分混匀，对照管以1 mL蒸馏水代替上清液，37 ℃恒温水浴30 min后取出，加入显色剂2 mL混匀，室温放置10 min，于550 nm波长处蒸馏水调零、比色。

1.4 数据处理与分析

以上指标每次测定设3 次平行，结果取平均值，并用Origin 8.5软件绘图，并使用SPSS Statistics 24软件对组间数据进行Duncan’s新复极差法显著性分析，P＜0.05代表存在显著差异。

2 结果与分析

2.1 保鲜剂的初步选择

图1 单一、复合保鲜液处理后鲜切菠菜的货架期Fig. 1 Shelf life of fresh-cut spinach treated with single and combined preservatives

如图1所示，CK组的货架期为8 d，对于ε-PL处理组，B组鲜切菠菜货架期最长，为11 d；对于AA处理组，E组鲜切菠菜货架期最长，为10 d；对于复合保鲜液处理组，K组鲜切菠菜货架期最长，为12 d。故以CK组为对照，对B、E、K组进行详细的理化指标分析。

2.2 保鲜剂对菠菜的抑菌效果

表3 牛津杯法测定不同保鲜液的抑菌效果Table 3 Antimicrobial activity of different treatments determined by Oxford cup assay

由表3及图2可得，B、K组对菌落总数、假单胞菌（荧光假单胞菌）、肠杆菌（成团泛菌）、微球菌（金黄色葡萄球菌）均有不同程度的抑制，但E组无明显抑菌作用。由图2A可知，K组菌落总数在贮藏期间增长最缓慢，在贮藏末期（12 d）菌落总数为5.89（lg（CFU/g）），显著低于CK、B、E组的6.32、6.23、6.42（lg（CFU/g））（P＜0.05）。由图2B、C可知，B、K组在贮藏期前8 d对假单胞菌和肠杆菌具有明显的抑制效果，且对假单胞菌的抑制效果差异不明显，但从肠杆菌的抑制效果来看，K组显著优于B组。在10 d之后B、K组间对肠杆菌的抑制效果差异不显著，但仍优于E组，该结果同Papachristodoulou等[22]的研究结果一致。由图2D可知，B组和K组仅在前4 d对微球菌具有抑制作用，且两者抑制效果差异不明显。总的来说，K组的抑菌性能优于B组，E组无明显抑菌性能。

图2 鲜切菠菜贮藏过程中总菌及优势腐败菌的变化Fig. 2 Changes in total bacteria and dominant spoilage bacteria in fresh-cut spinach during storage

2.3 不同保鲜剂处理对鲜切菠菜感官评分的影响

通过感官可以直观地评价鲜切菠菜的品质。由图3可知，随着贮藏时间延长，鲜切菠菜的感官得分呈下降趋势，在贮藏前4 d各组样品无显著差异（P＞0.05），第8天时，CK组叶片出现大面积萎蔫、发黄和不同程度的软腐，鲜切部位出现褐变，打开包装可明显感受到异味，且感官得分低于5 分，已失去商品价值。B、E、K组的鲜切菠菜在第8天仅出现小部分萎蔫，未见发黄、软腐，打开包装仍存在菠菜的固有气味、无异味，这表明3 种保鲜液均可以延长鲜切菠菜的货架期，减少软腐，从而保持品质。

图3 不同处理方式对鲜切菠菜感官品质的影响Fig. 3 Effects of different treatments on sensory quality of fresh-cut spinach

2.4 不同保鲜剂处理对鲜切菠菜色差的影响

随着贮藏时间的延长，果蔬品质会发生劣变，往往伴随着色泽的变化，因此色差可以直观地反映鲜切菠菜的品质变化[23]，其中L*值代表明暗指数，色度角h值可以综合反映叶片褪绿情况和黄化程度[18]。在贮藏前期，各样品的L*值呈上升趋势（图4A），这是因为鲜切菠菜叶绿素分子被破坏导致亮度增加、黄化加速；在贮藏后期，各样品的L*值呈下降趋势，这是因为临近贮藏终点时，一方面微生物大量繁殖；另一方面机体代谢紊乱同时又处于低温环境易发生冷害，最终导致叶片软腐、发黏，故颜色加深发黑，这也解释了h值均呈下降趋势的现象（图4B）。从L*值来看，CK组在6 d后开始下降，B、E组样品均在8 d后开始下降，而K组样品则10 d后开始下降，这表明各实验组均可有效延缓叶片发生冷害，从h值来看，K组样品在整个贮藏期间变化幅度最小，其次是E组，最后为B组。综上表明，K组鲜切菠菜色泽的变化是最缓慢的，冷害程度最小，最有利于维持鲜切菠菜的色泽品质。

图4 不同处理方式对鲜切菠菜L*（A）、h（B）的影响Fig. 4 Effects of different treatments on L* (A), h (B) of fresh-cut spinach

2.5 不同保鲜剂处理对鲜切菠菜叶绿素含量的影响

图5 不同处理方式对鲜切菠菜叶绿素含量的影响Fig. 5 Effects of different treatments on total chlorophyll content of fresh-cut spinach

采收后经过鲜切处理的菠菜失去光合作用的能力，叶绿体自身不能更新且被分解，叶绿素分子遭到破坏，不仅含量降低还影响色泽[24]。由图5可知，各处理组叶绿素含量均随着时间的延长而降低，前4 d各组叶绿素含量差异不显著，之后CK组叶绿素含量迅速下降，在第8天由初始值2.07 mg/g降至1.47 mg/g，而B、E、K组分别下降至1.61、1.59、1.70 mg/g；在贮藏后期（8 d后），各处理组叶绿素含量由高到低依次为：K组＞B组＞E组，这可能是因为8 d后鲜切菠菜表面细菌大量繁殖并产酸，改变了pH值，而叶绿素分子对pH值的变化极度敏感，加剧了脱镁反应，导致叶绿素含量降低，而K组和B组具有良好的抑菌性能，极大地抑制了细菌产酸。

2.6 不同保鲜剂处理对鲜切菠菜质量损失率的影响

图6 不同处理方式对鲜切菠菜质量损失率的影响Fig. 6 Effects of different treatments on water loss of fresh-cut spinach

质量损失主要来自于水分蒸发和呼吸消耗两个方面，其中水分蒸发引起的损耗是主要方面[25]。鲜切菠菜组织内水分质量分数约为92%，新鲜叶片挺直主要依靠体内水分压力，如果水分流失，细胞膨压会降低，表观上可以观察到叶片萎蔫、皱缩，因此测定水分变化对评价鲜切菠菜样品品质十分重要。由图6可知，随着贮藏时间的延长，各处理组质量损失率逐渐增加，且CK组失水最快，在第8天质量损失率超过5%，大部分叶片出现萎缩；复合处理组对控制鲜切菠菜的失水效果最好，两个单一处理组的效果相近。

通过绘制并反演计算各个处理组在不同时期样品T2弛豫时间，通过计算峰面积及峰比例可以反映样品在贮藏前期（第0天）、贮藏中期（第6天）、贮藏末期（第12天）叶片中结合水（T21：0～2 ms）、不易流动水（T22：2～20 ms）、自由水（T23：20～1 000 ms）的迁移情况[26]。由表4可知，在0～6 d内CK、E组中结合水相对含量分别下降6.0%、2.4%，B、K组结合水相对含量分别上升6.0%、1.2%。CK组和B组在0～6 d内自由水相对含量分别下降8.9%、5.2%，高于6～12 d的下降幅度（3.7%、4.6%），这是因为经过鲜切处理后的菠菜呼吸旺盛、代谢加快带动机体更快地蒸腾失水[26]，故贮藏前期失水较快。到了贮藏末期，CK组结合水相对含量最低（0.69%），这表明细胞结构已被破坏；B、E两组自由水的相对含量仍为80%以上，这可能与ε-PL具有一定的成膜性相关，抑制了自由水相对含量的降低[7]。K组结合水相对含量增加，可能是因为复合处理增强了机体对不良环境的耐受，抗逆反应强烈主要通过减少自由水一方面使得机体新陈代谢速率下降；另一方面通过增加结合水含量增强抗逆能力[27]。

表4 不同处理方式对鲜切菠菜水分迁移的影响Table 4 Effects of different treatments on water mobility in fresh-cut spinach

2.7 不同保鲜剂处理对鲜切菠菜MDA含量、SOD活力的影响

图7 不同处理方式对鲜切菠菜MDA含量的影响Fig. 7 Effects of different treatments on malondialdehyde content of fresh-cut spinach

鲜切菠菜在贮藏过程中，超氧阴离子自由基（O2－·）对细胞膜、线粒体内膜中的不饱和脂肪酸进行攻击，启动并促进了膜脂过氧化进程[28]，该进程的主要产物是MDA，因此MDA含量是判断膜脂过氧化程度的标志[29]。由图7可知，各组样品MDA含量随着时间的延长而增加，但各个处理组的MDA含量整体上均低于对照组。在贮藏前6 d，E组MDA含量显著低于B组，这表明AA能够明显抑制样品细胞膜脂过氧化作用，与Liang Guobin等[30]的研究结果一致；但在第8天时，两者MDA含量差异不显著（P＞0.05）；K组在整个贮藏期间MDA含量均显著低于其他处理组（P＜0.05）。

图8 不同处理方式对鲜切菠菜SOD活力的影响Fig. 8 Effects of different treatments on SOD activity of fresh-cut spinach

SOD是植物氧化代谢中最重要的一种抗氧化酶，主要功能是与O2－·发生歧化反应，从而最大限度地清除O2－·[31]。由图8可知，各组SOD活力均呈先上升后下降趋势，这是因为SOD的活性随植物体内O2－·产生速率的升高而增加[32]，当O2－·生成量超过SOD的清除能力时，SOD活力就开始逐渐下降，表明机体内O2－·的动态平衡被打破，机体将加速衰老。CK组和B组的样品SOD活力在第4天达到最高，分别为230.15、227.21 U/g，E组和K组的鲜切菠菜分别在第6、8天达到最高值，分别为247.36、255.67 U/g。在第12天时，K组SOD活力最高（190.25 U/g），其次为E组，最后为B组。

综合MDA含量和SOD活力的结果发现，复合保鲜液处理控制鲜切菠菜膜脂过氧化进程效果最好，MDA含量均显著低于其他处理组（P＜0.05），同时SOD活力也保持最高，其次是AA单一处理，ε-PL单一处理效果不如其他两种处理，但是在一定程度上仍优于CK组。

3 结 论

在所有处理组中，K组处理（0.05 g/Lε-PL＋10 g/L AA）对鲜切菠菜的保鲜的效果最好，在贮藏期间可有效控制色泽发生劣变，抑制总菌、特定腐败菌的增长，延缓膜脂过氧化进程，在贮藏末期，K组菌落总数最低，为5.89（lg（CFU/g）），SOD含量最高（190.25 U/g），货架期最长（12 d）；0.05 g/L的ε-PL单一处理对鲜切菠菜具有良好的抑菌性能，但调控活性氧代谢能力一般，可使鲜切菠菜货架期延长至11 d；10 g/L AA无明显抑菌性能，主要是通过改善鲜切菠菜活性氧代谢维持品质，货架期可达10 d。