凝结芽孢杆菌影响蛋鸡产蛋后期生产性能的机理研究

邢冠润，郎芯蕊，吴吉安，楼洪兴，刘文强，张恒硕，董信阳，潘晓亮，王友明*

（1.石河子大学动物科技学院，新疆石河子 832003；2.浙江大学动物科学学院，浙江杭州 310012；3.浙江省农业科学院，浙江杭州 310021）

在高密度养殖条件下，产蛋鸡尤其在产蛋后期更易受多种应激影响，引发生产性能下降、发病率升高等一系列问题，应用抗生素曾经是解决该问题的很好手段。但近年来美国及西欧一些国家相继禁用或限用抗生素作为饲料添加剂，我国2015 版《中国兽药典》及农业部（现“农业农村部”）1435、1506 公告已经明令禁止部分抗生素在蛋鸡生产中的使用。因此，抗生素替代技术的研究备受关注，如在日粮中添加微生态制剂、植物提取物、中草药制剂、酶制剂等，以及采用营养抗病技术、改变光照、加强消毒免疫等手段。凝结芽孢杆菌既具有维持肠道微生态平衡、刺激免疫、提高机体健康水平、促进消化等优点，又具有抗逆性强、可定植等生物特性[1]，是安全饲料添加剂研究的热点。大量研究表明，蛋鸡日粮中添加凝结芽孢杆菌具有促进蛋鸡生产性能的作用[2-4]，但对其可能影响蛋鸡产蛋性能机制的研究较少。本试验通过探究在饲粮中添加不同水平的凝结芽孢杆菌制剂对产蛋鸡后期的生产性能、血清生化指标、肠道消化酶活性、生殖激素水平及相关受体基因表达量的影响，探究其可能的作用机制，为今后凝结芽孢杆菌制剂在蛋鸡上的生产应用提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料 凝结芽孢杆菌制剂（菌株WS4-1 获得中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心的菌保号CGMCCNO.7023），经浙江省农业科学院植物保护与微生物研究所测定，本批次产品（批次号：2017091501）含凝结芽孢杆菌3.12×1011CFU/g 及其代谢产物，芽孢形成率85.2%。

1.2 试验设计及饲养管理 选取648 羽66 周龄健康、体重、产蛋率基本一致的“京粉1 号”蛋鸡，随机分为4 个组，每组6 个重复，每个重复27 羽。对照组饲喂无抗基础饲粮，试验Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组分别在无抗基础料中添加3.33×106、1×107、3.33×107CFU/g 凝结芽孢杆菌。试验于2018 年4 月21 日—6 月22 日在海盐县叶盛禽业养殖场进行，预试期1 周，饲喂基础日粮，正试期8 周。

无抗基础饲粮结合生产实践，同时参照美国 NRC（1994）蛋鸡营养需要配制，配方组成和主要营养成分见表1。蛋鸡采用3 层阶梯式笼养，每天恒定光照16 h，自然通风，由专人饲养。饲喂量：前4 周·110 g/（d·只），后4 周112 g/（d·只），自由饮水，每天13:30 饲喂，15:00 收蛋，消毒、免疫程序按常规进行。

表1 无抗基础日粮组成和主要营养成分

1.3 采样与保存 试验结束次日进行屠宰采样，随机从每组中选取大小基本一致的蛋鸡12 只 （每个重复2 只） 空腹称重（断料12 h），颈动脉放血，待析出血清后3 000 r/min 离心10 min 分离血清，再分装在离心管中，并于-20℃冰箱保存。取卵巢并尽量剔除大部分卵泡后置于冻存管中-80℃保存。十二指肠、空肠、回肠中段靠后1 cm 处各取0.5 g 左右黏膜，置于1.5 mL 的离心管中，-80℃冷冻保存待用。取样称重并记录脾脏、肝脏、心脏、胰脏、卵巢的重量。

1.4 检测指标及方法

1.4.1 生产性能 每天定时记录各重复组的产蛋数、合格蛋重，计算产蛋率、平均合格蛋重、料蛋比。

产蛋率=产蛋数/试验鸡数×100%

平均合格蛋重=合格蛋总重/（产蛋数－破蛋数－软壳蛋数）

料蛋比=日采食量/日产平均合格蛋重

1.4.2 器官指数 计算脾脏指数、肝脏指数、心脏指数、胰脏指数、卵巢指数等。器官指数计算公式：

器官指数=器官重（g）/宰前活重（kg）

1.4.3 血清生化指标 测定指标包括总蛋白（TP）、白蛋白（ALB）、球蛋白（Glob）、白球比（A/G）、碱性磷酸酶（ALP）、葡萄糖（Glu）、总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、钙（Ca）、磷（P）、尿素（Urea）。采用全自动生化分析仪（OLYMPUSAU5421+ISE 型，日本OLYMPUS 公司）测定，于杭州市第二人民医院完成。

1.4.4 小肠黏膜消化酶活性 取小肠黏膜0.1 g 左右，加入4℃生理盐水0.9 mL，加入钢珠充分匀浆，将匀浆液在4℃ 3 000 r/min 条件下离心10 min，取上清液分装与1.5 mL 的Eppendorf 管中待测。淀粉酶、脂肪酶、蛋白酶活性及组织蛋白浓度采用考马斯亮兰法进行，试剂盒购自南京建成生物工程研究所，按说明书步骤进行。

1.4.5 血清生殖激素及卵巢受体基因表达量 血清促卵泡素（FSH）、促黄体生成素（LH）采用ELISA 试剂盒测定，试剂盒购自南京建成生物工程研究所，试剂的配制和操作严格按说明书步骤进行。雌二醇（E2）在杭州市第二人民医院完成测定。

促黄体生成素受体（LHR）及血清促卵泡素受体（FSHR）和18S RNA（内参基因）的引物由委托宝生物工程（大连）有限公司设计并合成。称取50～100 mg 卵巢样品，采用RT-PCR 逆转录两步法反转录试剂盒（Bioer）进行总RNA 提取及cDNA 合成。对样品的cDNA 和内参基因进行扩增，反应程序：预变性：50.0℃，2 min；95.0℃10 min。PCR 反应：95.0℃，10 s；60℃，30 s；采集荧光信号，共 40 个循环。熔解曲线分析：60℃升至 95.0℃，60℃保温 1 min，95℃保温15 s，自动采集荧光。1.5 统计分析 运用SPSS 16.0 软件进行统计，采用单因子方差分析进行差异显著性检验，最小显著差数法（LSD）进行多重比较，结果均以平均值±标准差表示，以P＜0.05 作为差异显著性判断标准。基因表达量采用 2-△△Ct法进行计算。

2 结 果

2.1 凝结芽孢杆菌制剂对蛋鸡产蛋性能和器官指数的影响 由表2 可知，试验Ⅰ组产蛋率较对照组相比提高了2.03%（P＜0.05）。试验Ⅰ组平均合格蛋重较对照组降低了0.64%（P＜0.05）。试验Ⅱ组料蛋比校对照组降低2.26%（P＜0.05）。与对照组相比，试验Ⅱ组脾脏指数提高了104.76%（P＜0.05）；4 组的心脏指数、肝脏指数、卵巢指数无显著差异。

2.2 凝结芽孢杆菌对蛋鸡血清生化指标的影响 由表3可知，相比对照组，试验Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组ALP 分别提高11.58%、11.53%、19.29%（P＜0.05），试验Ⅰ、Ⅱ组TG 分别降低16.40%、13.67%（P＜0.05），3 个试验组的Ca 分别提高7.11%、5.58%、5.25%（P＜0.05）；相比对照组，试验Ⅰ、Ⅲ组Urea 均降低7.94%（P＜0.05）。饲粮中添加不同水平凝结芽孢杆菌对血清TP、ALB、Glob、A/G、Glu、P、TC 均无显著影响。

2.3 凝结芽孢杆菌对蛋鸡小肠黏膜消化酶比活力的影响 由表4 可知，相比对照组，试验Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组十二指肠淀粉酶比活力分别提高了65.63%、34.38%、25.00%（P＜0.05），十二指肠脂肪酶比活力分别提高了28.03%、56.48%、43.34%（P＜0.05）， 十 二 指 肠蛋白酶比活力分别提高了14.27%、42.58%、27.93%（P＜0.05）。相比对照组，试验Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组空肠淀粉酶比活力分别提高了37.90%、65.32%、77.42%（P＜0.05），空肠脂肪酶比活力分别提高了36.37%、59.14%、40.18%（P＜0.05），空肠蛋白酶比活力分别提高了14.69%、52.53%、29.12%（P＜0.05）。相比对照组，试验Ⅰ、Ⅱ组回肠淀粉酶比活力分别提高了24.00%、60.00%（P＜0.05），试验Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组回肠脂肪酶比活力分别提高了33.85%、53.24%、40.11%（P＜0.05），回肠蛋白酶比活力分别提高了24.05%、39.12%、28.70%（P＜0.05）。

表2 凝结芽孢杆菌对蛋鸡生产性能及器官指数的影响

表3 凝结芽孢杆菌对蛋鸡血清生化指标的影响（n=12）

2.4 凝结芽孢杆菌对蛋鸡血清生殖激素和卵巢FSHR、LHR mRNA 表达量的影响 由表5 可知，相比对照组，试验Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组FSH 分别提高14.74%、25.69%、14.74%（P＜0.05），E2分 别 提 高6.96%、8.17%、14.22%（P＜0.05）。各试验组的血清LH 水平有提高趋势（P＞0.05）。各试验组的卵巢FSHR mRNA 表达量随着剂量的升高呈先上升后下降的变化特点，与对照组相比，试验Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组分别提高53.27%、58.88%、54.21%（P＜0.05）。LHR mRNA 的表达量变化规律与FSHR mRNA 类似，但各组间差异不显著。

3 讨 论

3.1 凝结芽孢杆菌制剂对产蛋鸡生产性能和器官指数的影响 本试验结果表明，产蛋后期蛋鸡日粮中添加适量的凝结芽孢杆菌可提高蛋鸡产蛋率和降低料蛋比；可显著提高蛋鸡的脾脏指数，对心脏指数、肝脏指数、胰脏指数有提高趋势。赵必迁等[2]研究发现，饲粮中添加凝结芽孢杆菌可显著提高产蛋高峰期的产蛋率，降低破蛋率。黄遵锡等[4]研究发现，饲粮中添加凝结芽孢杆菌可显著降低不合格蛋率，降低料蛋比。陈晓帅等[5]研究发现，在肉鸽饲粮中添加复合益生菌提高了乳鸽的脾脏指数、心脏指数。赵娜等[6]研究结果显示，饲粮中添加凝结芽孢杆菌可提高免疫器官指数，降低死淘率。这可能是由于凝结芽孢杆菌在肠道内可大量繁殖，不断合成有益物质，可作为抗原刺激免疫器官生长发育，适度提高蛋鸡免疫水平[7]，从而提高蛋鸡生产性能。

3.2 凝结芽孢杆菌对蛋鸡血清生化指标的影响 本试验中，在产蛋后期蛋鸡日粮中添加凝结芽孢杆菌可显著提高血清中ALP、Ca、P 含量，显著降低血清中TG、Urea 含量，对TP、ALB、Glob、A/G、Glu 含量均有提高作用，TC 含量有降低趋势。林丽花等[8]研究发现，在黄羽肉鸡饲粮中添加凝结芽孢杆菌对血清中TP、ALB、ALP 含量均有提高作用。黄世猛等[9]报道，凝结芽孢杆菌能降低蛋鸡血清TG 和TC 含量，促进蛋鸡Ca、P 的消化吸收。以上研究结果提示，凝结芽孢杆菌具有加强蛋白质合成代谢[10]，降低分解代谢的作用，改善肠道健康，提高Ca、P 吸收，为蛋鸡生产性能的提高提供营养保证，从而提高蛋鸡生产性能。

表4 凝结芽孢杆菌对蛋鸡小肠黏膜消化酶比活力的影响（n=12）

表5 凝结芽孢杆菌对蛋鸡血清生殖激素水平和卵巢FSHR 、LHR mRNA 表达量的影响（n=12）

3.3 凝结芽孢杆菌对蛋鸡小肠黏膜消化酶比活力的影响 本试验发现，饲喂凝结芽孢杆菌可显著提高产蛋后期蛋鸡小肠黏膜淀粉酶、脂肪酶和胰蛋白酶比活力。匡群等[11]研究表明，饲料中添加凝结芽孢杆菌可显著提高武昌鱼的蛋白酶活力、蛋白质利用效率和生长率。曾丽莉等[12]研究发现，饲料中添加凝结芽孢杆菌能显著提高肉鸭十二指肠淀粉酶活性和胰蛋白酶活性。这可能由于凝结芽孢杆菌可产生乳酸降低肠道pH，产生淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶等多种酶类和酶促因子，降解果胶、葡聚糖、纤维素等复杂的碳水化合物[13-15]，提高肠道中消化酶的比活力，改善机体消化功能，促进营养物质的消化吸收，进而提高蛋鸡生产性能。

3.4 凝结芽孢杆菌对蛋鸡血清生殖激素及卵巢受体基因表达量的影响 本试验研究表明，添加不同剂量的凝结芽孢杆菌显著提高了FSH 和E2的浓度，对LH 有提高趋势；卵巢LHR mRNA 和FSHR mRNA 的表达量与LH 和FSH 呈相同的变化规律。Lei 等[16]报道，地衣芽孢杆菌能提高蛋鸡血清FSH 和E2含量。丁阳等[17]研究认为，血清FSH 含量与卵巢FSHR mRNA、LHR mRNA 表达量呈较强的正相关。该菌可能是通过提高机体代谢、蛋白合成、调控激素分泌等途径，使卵巢生殖系统更加健康，促进卵巢上繁殖相关受体基因表达，从而对卵巢上卵泡发育造成影响，进而提高其产蛋性能。

4 结 论

凝结芽孢杆菌制剂可显著提高产蛋后期蛋鸡的产蛋率，降低料蛋比，提高蛋鸡生产性能。凝结芽孢杆菌提高蛋鸡生产性能的主要机理：①适当提高产蛋后期蛋鸡的免疫力、消化能力，进而改善血清生化指标，提高蛋白合成能力。②促进性腺激素释放和卵巢上繁殖相关受体基因表达。