川硬皮肿腿蜂学习经历对花椒与虎天牛虫粪挥发物的行为反应测定

马 琴，邵林娟，杨 桦*

(1.九龙县林业和草原局，四川 九龙 616200，2.四川农业大学林学院 四川省林业生态工程省级重点实验室，四川 成都 611130)

川硬皮肿腿蜂(SclerodermasichuanensisXiao)属膜翅目肿腿蜂科(Bethylidae)天牛肿腿蜂属(Scleroderma)。由四川农业大学森保实验室周祖基、曾垂慧教授发现于四川，中国林科院森保专家萧刚柔先生1995年鉴定为新种并命名[1]，是一种能防治杉综天牛(CallidiumvillosulumF.)、粗鞘双条杉天牛(SemanotussionansterGressitt)、双条杉天牛(S.bifasciatusMotschulsky)、花椒虎天牛(ClytusvaliandusF)等钻蛀性害虫的寄生性天敌昆虫[2]。目前和管氏肿腿蜂(SclerodermaguauiXiao et Wu)一起广泛应用于松墨天牛(MonochamusalternatusHope)、花椒虎天牛(ClytusvaliandusFairmaire)、青杨天牛(SaperdapopulneaL.)、双条杉天牛等林业害虫的生物防治。该蜂在自然界数量少，分布范围窄，需要在室内大量繁殖，才能对害虫进行有效的控制。

花椒虎天牛在四川花椒各产地皆有分布, 主要危害5年生以上花椒树(ZanthoxylumbungeanumMaxim), 10年生以上椒树危害率最高[6]。该虫主要取食树干基部韧皮部或多年生主侧枝, 未见危害1～2年生嫩枝。被害株基干部常被多头幼虫共同危害, 当其围绕树干韧皮部蛀食一圈后, 造成整株树的枯死。越西县花椒420万株，遭受花椒虎天牛危害的危害率达56.35%，其中，每年被害致死的死亡率为13.92%[7]。仅在四川汉源县每年因该虫危害导致近8%的花椒树死亡，且多是成年挂果树，年经济损失300余万元[8]。目前对于花椒虎天牛的防治主要以人工捕杀成虫幼虫、诱捕器捕杀、化学防治等物理与化学方法[9,10]。但是这些方法比较费时费力，污染环境，最终也无法有效控制花椒虎天牛的危害。花椒虎天牛幼虫期长, 若采用寄生蜂防治, 有利于天敌增殖, 可提高生防效果。因此，生物防治特别是运用寄生蜂防治越来越引起人们的重视，其不仅克服了物理与化学防治方法的缺点，而且其目的在于控制害虫种群数量，而不是对害虫的彻底消灭，在维持生态平衡上具有重要意义。

本文采用Y型嗅觉仪和触角电位仪研究羽化初期川硬皮肿腿蜂对花椒挥发物、花椒虎天牛虫粪木屑混合物诱导的学习效应，比较有无学习经历的川硬皮肿腿蜂对不同花椒浓度挥发物的行为反应，以探索利用学习行为提高川硬皮肿腿蜂防治花椒虎天牛效果的途径。

1 材料与方法

1.1 供试虫源和材料

供试肿腿蜂为四川农业大学森林保护省级重点实验室用黄粉虫(TenebriomolitonL.)蛹繁殖的川硬皮肿腿蜂雌成蜂，于肿腿蜂即将羽化时，挑选蜂量中等、蜂茧干净无污染的繁蜂管置于25±1℃，相对湿度60%～70%的人工气候箱中培养供试。

采集5年生以上的花椒树的健康枝条和被花椒虎天牛为害枝条的天牛虫粪木屑混合物，材料采用保鲜袋密封，置于4℃冰箱中保存备用。

1.2 味源收集

用采样袋(Oven Bags，美国Reynolds公司)分别套住不同处理的健康花椒枝条(36 g)和天牛虫粪木屑混合物(36 g)，在采样袋两对角插入Tanex-TA填充的玻璃管(吸附剂50 mg，60～80目；玻璃管外径6 mm、长85 mm，美国Supleco公司)和活性碳空气过滤管，并用Teflon管分别连接大气采样器(QC-1型大气采样仪, 北京劳动保护科学研究所)的进、出气口，以0.5 L·min-1的空气流速，动态吸附采集6 h。然后，用5 mL重蒸乙醚(化学纯，成都市科龙化工试剂厂)洗脱，N2吹送浓缩至2 mL，用于行为反应测定。

1.3 川硬皮肿腿蜂对挥发性信息化合物的学习处理

将正己烷收集的健康枝条与虫粪木屑混合物挥发成分设置5个浓度梯度：0.01 g·mL-1，0.1 g·mL-1，1 g·mL-1，10 g·mL-1，100 g·mL-1；共计10个处理。在25℃下，川硬皮肿腿蜂蛹期为20 d，在幼虫结茧15 d后，挑选出一定数量结茧较佳的指形管，每个处理取10 μL混合溶液滴于2 cm×0.5 cm的滤纸条上，待溶液挥发后，将滤纸片置于指形管中用棉花封存，成虫羽化后当天取出。

1.4 触角电位生理反应测定

触角电位测定采用荷兰Syntech公司生产的触角电位仪。测定前用解剖刀将川硬皮肿腿蜂触角自柄节从头部挑出；用Spectra 360导电胶将其固定在PR (Gain10×)电极上，气味管与触角相距1 cm。测定方法按照杜永均等[11]的方法进行。用微量取样器抽取10 μl溶液,均匀地滴在2 cm×0.5 cm的滤纸条上，放入10 cm长的样品管中，样品管末端连接气体刺激控制装置。待基线稳定后给予刺激，每次刺激时间为0.5 s，刺激间隔为30 s，以保证触角感受能够完全恢复。实验每处理测试触角6根，每样品平均刺激5次。以重蒸正己烷为对照，将每一样品观测值的平均数除以前后2次对照测定值的平均值即得EAG反应相对值。

1.5 行为反应检测

采用“Y”型嗅觉仪测定川硬皮肿腿蜂行为反应。“Y”型玻璃管长臂10 cm，短臂长5 cm，内径均为1 cm，两臂夹角75°，交叉处由标准磨口制成，两侧臂分别用Teflon管与10 cm长的样品管相连。一样品管放置气味源，另一样品管设为空白。样品管用Teflon管依次连接蒸馏水加湿瓶(300 mL)，填装活性炭的空气净化瓶(500ml)，然后连接到大气采样器排气口。控制空气流0.1 L·min-1～0.2 L·min-1,测量时间为8：00～12：00，温度为25±2℃。

生测时，吸取10μL溶液滴在滤纸条(2 cm×0.5 cm)上,待溶剂挥发后，将滤纸条分别置于一容量瓶中,作为信号源，另一容量瓶设为空白。将肿腿蜂由Y型管长臂管口引入(每次1头)，爬过长臂管口2 cm后开始计时，寄生蜂在Y型管分叉处做出选择，取向不同的侧臂。每头蜂观察5 min，爬过侧臂3 cm,且停留时间1 min以上记为对该气味有选择，否则记为无选择。记录每个有效选择的时长以待比较。每处理随机测定肿腿蜂30头，每测5头调换Y型管两臂位置，以消除管臂位置对寄生蜂行为可能产生的影响，每个处理测量完成后更换嗅觉仪，用酒精彻底清洗Y型管和连接的Teflon管及容量瓶，自然晾干，Y型管和容量瓶在100℃下烘干24 h，以消除不同处理间气味残留的影响。

1.6 数据统计与分析

所有试验数据采用SPSS 17.0软件进行统计分析，用Excel 2007和Word 2007作图。生测数据采用χ2检验比较差异显著性[12]，采用Duncan’s多重分析法比较各处理间的差异。

2 分析与结果

2.1 不同学习经历的川硬皮肿腿蜂对各味源的行为反应

2.1.1 花椒枝条处理的川蜂对花椒枝条挥发物行为反应

羽化期经历花椒枝条挥发物的川硬皮肿腿蜂行为生测结果如图1所示，羽化期经历味源A的川硬皮肿腿蜂对味源A有一定的趋向性。其中，羽化期经历10 g·mL-1的花椒枝条挥发物，花椒枝条对川硬皮肿腿蜂的引诱率显著高于驱避率(p<0.05)。

无学习经历川蜂对花椒枝条挥发物的行为反应见图2。卡方检验表明，味源A1～A5对无学习经历蜂没有明显引诱作用。当味源浓度增加。对无学习经历蜂驱避作用明显增强。

2.1.2花椒虎天牛虫粪木屑处理的川蜂对花椒枝条挥发物行为反应

羽化期经历花椒虎天牛虫粪木屑的川硬皮肿腿蜂行为生测结果如图3所示，羽化期经历味源B的川硬皮肿腿蜂对味源B有一定的趋向性。其中，羽化期经历10 g·mL-1的花椒虎天牛虫粪木屑，花椒虎天牛虫粪木屑对川硬皮肿腿蜂的引诱率显著高于驱避率(p<0.05)。

无学习经历川硬皮肿腿蜂对虫粪木屑混合挥发物的行为反应见图4。卡方检验表明，味源B1～B5对无学习经历蜂没有明显引诱作用。当味源浓度增加。对无学习经历蜂驱避作用明显增强。

2.2 川硬皮肿腿蜂对不同浓度味源的行为反应多重比较

从羽化期经历不同味源的川硬皮肿腿蜂对不同浓度味源的行为反应多重比较可以看出(见表1)，羽化期经历10 g·mL-1花椒枝条挥发物的川硬皮肿腿蜂对味源的行为反应率最高，达到66.67%，与其余9种处理间存在显著差异(P<0.05)，其次是羽化期经历10 g·mL-1虫粪木屑挥发物的肿腿蜂对味源的行为反应率64.44%。而经历0.01 g·mL-1花椒枝条与虫粪木屑挥发物的肿腿蜂反应率最低。

图1 羽化期经历味源A的川硬皮肿腿蜂对各味源浓度的行为反应Fig. 1 Behavioral response of emergence period through the odor source A of scleroderma sichuanensis to different sources注：χ2检验中的 “n.s”表示P>0.05，“*”表示P<0.05。下同。A气味源为花椒枝条挥发物，A1～A5分别为不同浓度0.01 g·mL-1、0.1 g·mL-1、1 g·mL-1、10 g·mL-1、100 g·mL-1。

图2 无学习经历蜂对味源A1～A5的行为反应Fig. 2 Behavioral responses of Scleroderma sichuanensis without learning experience to source A1～A5

图3 羽化期经历味源B的川硬皮肿腿蜂对各味源的行为反应Fig. 3 Behavioral response of emergence period through the odor source B of scleroderma sichuanensis to different sources注：B气味源为花椒虎天牛虫粪木屑混合提取物，B1～B5分别为不同浓度0.01 g·mL-1、0.1 g·mL-1、1 g·mL-1、10 g·mL-1、100 g·mL-1。

表1不同经历的川硬皮肿腿蜂选择率与电位值多重比较

Tab.1 ThedifferentexperiencesofsclerodermaSichuanensisselectionrateandEAGvaluemultiplecomparison

诱导源浓度选择率电位比值羽化期经历枝条羽化期经历虫粪0.01 g·mL-138.89±2.94e0.72±0.12b0.1 g·mL-142.22±4.84e0.86±0.19b1 g·mL-152.22±2.22d 0.89±0.12b10 g·mL-152.22±2.94d0.95±0.05b100 g·mL-155.56±1.11cd1.08±0.14ab0.01 g·mL-156.67±1.92bcd1.11±0.13ab0.1 g·mL-157.78±2.94bcd1.18±0.31ab1 g·mL-161.11±1.11abc1.19±0.23ab10 g·mL-164.44±2.22ab1.27±0.26ab100 g·mL-166.67±1.93a1.67±0.35a

注：表中数据为平均值±标准误，具不同大写字母的数据表示差异极显著(P<0.01，Duncan’s比较)，具不同小写字母的数据表示差异显著(P<0.05，Duncan’s比较)

2.3 川硬皮肿腿蜂对不同浓度味源的EAG反应

从羽化期经历不同味源的川硬皮肿腿蜂对不同浓度味源的EAG反应多重比较可以看出(见表1)，羽化期经历10 g·mL-1花椒枝条挥发物的川硬皮肿腿蜂对味源的EAG反应率最高，达到1.6737±0.3487，与其余9种处理间存在显著差异(P<0.05)。而经历1 g·mL-1花椒枝条与虫粪木屑挥发物、0.01 g·mL-1花椒枝条挥发物和10 g·mL-1花虫粪木屑挥发物的肿腿蜂反应率最低。

3 结论与讨论

寄生蜂羽化后, 面对的常是复杂多变的环境,它们必须高效的利用各种信号, 尽快找到合适寄主, 以繁衍后代[13]。寄主植物源物质是寄生蜂搜索过程中利用的一类主要信号, 其中由寄主昆虫取食诱导的挥发物尤为重要[14,15]。实践证明, 在影响寄生蜂寻找寄主的诸因素中化学因素起主导作用, 而这种化学因素又主要指利它素[16]。

图4 无学习经历蜂对味源B的行为反应Fig. 4 Behavioral responses of scleroderma Sichuanensis without learning experience to odor source B

实验可知，无处理蜂对A(花椒枝条挥发物)、B味源(花椒虎天牛虫粪木屑混合提取物)，特别是高浓度的A、B味源有明显趋避性。而在羽化期经过对A、B味源学习处理蜂，对A、B味源有了明显的趋向性，这说明，A、B味源确实对提高川蜂对花椒虎天牛的搜索寄生有一定的影响。其中，A味源对川蜂影响最显著的为A4气味源；B味源对川蜂影响最显著的为B4气味源。相比较无处理蜂分别对A、B气味源行为反应，经A味源学习处理蜂对A味源的趋向性更为明显，选择率也更为显著。

通过利用花椒枝条挥发气味和花椒虎天牛虫粪挥发物对川硬皮肿腿蜂的多次刺激，以及室内触角电位实验和Y型嗅觉仪的生测，证明通过用花椒枝条挥发物和花椒虎天牛虫粪对川硬皮肿腿蜂的驯化和刺激，确实提高了川硬皮肿腿蜂在花椒树上对花椒虎天牛的反应行为和辨别能力，这种结果是由于川硬皮肿腿蜂在羽化过程中，适应了花椒枝条挥发气味和花椒虎天牛虫粪气味，对于这两种气味有更高的辨别能力，经处理的川硬皮肿腿蜂对花椒虎天牛的搜索能力有显著提高。至于花椒枝条挥发物成分以及川硬皮肿腿蜂的嗅觉感受机制，有待于进一步的研究。