免疫亲和柱净化结合高效液相色谱法测定小麦粉中的脱氧雪腐镰刀菌烯醇

□ 王 果 郭芳芳 江苏省理化测试服务中心

脱氧雪腐镰刀菌烯醇是谷物等制品中的常见的一种污染性真菌毒素，是日常饮食中常见的污染霉菌毒素之一；因此灵敏、快速、准确的分析方法对保护人类健康至关重要[1]。在检测工作中小麦粉中的脱氧雪腐镰刀菌烯醇都是有检出的。如果食用过量的脱氧雪腐镰刀菌烯醇会对人体的免疫系统产生影响并会导致厌食、腹泻、呕吐等中毒表现，故脱氧雪腐镰刀菌烯醇又称为呕吐毒素。薄层色谱测定法、免疫亲和柱结合高效液相色谱法、同位素稀释液相色谱-串联质谱法是检测脱氧雪腐镰刀菌烯醇常用的方法[2]。本文使用免疫亲和柱结合高效液相色谱法检测小麦粉中的呕吐毒素，能很好地满足实验分析标准。

1 仪器及试剂

脱氧雪腐镰刀菌烯醇免疫亲和柱、紫外检测器或二极管阵列检测器（Agilent高效液相色谱仪）、超声波、涡旋振荡器、离心机、真空压力泵与玻璃注射器。

2 标准储备溶液及标准工作溶液

标准储备溶液（25 μg/mL）：移取1 mL标准储备溶液于10 mL容量瓶中，用乙腈定容至刻度线，并存放于4 ℃的环境中保存。

标准工作溶液配制：准确移取适量的配制好的储备溶液，用10%乙腈分别稀释成浓度为0.1、0.2、0.5、1、2、5 μg/mL的标准工作溶液。

3 实验方法

3.1 小麦粉样品的前处理

（1）提取：称约2 g（准确到0.001）的样品，加入10 mL水涡旋混匀1 min，并超声后离心，取2 mL上清液。

（2）净化：将真空压力泵与玻璃注射器相连接，先将低温保存的免疫亲和柱恢复至室温，再插到玻璃注射器上，待柱内原有液体流至柱体下端1 cm左右后，将2 mL上清液转移至柱中过柱，直至空气进入柱中[3]。用离子色谱水淋洗亲和柱，直至空气进入柱中，抽干免疫亲和柱，弃去全部流出液。

（3）洗脱：准确加入1 mL甲醇洗脱免疫亲和柱，并收集全部洗脱液至试管中；涡旋30 s混匀溶解残留物，用0.45 μm有机滤膜过膜，收集甲醇洗脱的滤液于进样小瓶中以备进样。

3.2 仪器条件及检测

3.2.1 液相色谱条件

流动相为甲醇∶水（1∶4）；流速0.8 mL/min；检测波长218 nm；柱温35 ℃；进样量20 μL；液相色谱柱为C18柱（填料粒径5 μm，柱长150 mm，柱内径4.6 mm）。

3.2.2 样品的检测

根据以上液相色谱条件进样20 μL，采用峰面积定量，保留时间定性，求出小麦粉中脱氧雪腐镰刀菌烯醇（DON）的含量。

4 分析结果

4.1 脱氧雪腐镰刀菌烯醇标准色谱图

免疫亲和柱结合高效液相色谱法根据色谱条件，得到没有拖尾、分离度良好的标准色谱图[4]。

4.2 检出限及线性

相关系数及线性回归方程是根据5个色谱标准点峰面积。以3倍的检出限定义为定量限，在该色谱条件下，脱氧雪腐镰刀菌烯醇的回归方程、相关系数及定量限见表1。

表1 脱氧雪腐镰刀菌烯醇的回归方程、相关系数及定量限

4.3 精密度试验及加标回收率

本方法采用检测小麦粉中的DON，结果显示脱氧雪腐镰刀菌烯醇有检出。小麦粉中DON含量为120 mg/kg，回收率为90.6%，RSD为2.1%。

5 结论

使用免疫亲和柱净化结合高效液相色谱法检测小麦粉中的脱氧雪腐镰刀菌烯醇，方法灵敏、快速、准确，处理样品时工作量小，为检测人员检测其他谷物中脱氧雪腐镰刀菌烯醇提供参考。