接骨胶囊质量标准研究

崔维刚，蒋胜岳，周利章，耿燕楠

(1.临沂市行政审批服务局，山东 临沂 276001；2.临沂市检验检测中心，山东 临沂 276001； 3.山东中医药大学附属医院，山东 济南 250000)

接骨胶囊为沂南攀峰骨科医院生产品种，1999年7月起试行，制剂原名称为“潘氏接骨灵胶囊(Ⅰ号)”。该品种由桃仁、红花、当归、土鳖虫、骨碎补等21味中药组成，在临床上具有较好的疗效。其功效主要为活血化瘀，续筋接骨。用于各种骨折、跌打损伤等。

目前，该制剂现行质量标准中，仅包含4个显微特征的鉴别以及血竭、当归和川芎的薄层鉴别[1]。接骨胶囊作为临沂市的医疗机构制剂，具有比较好的临床疗效及销量，但由于该处方涉及的中药药味数量较多，而中药材来源、质量差别较大，仅以现行标准难以确保该制剂的质量。因此，在当前国家药典标准大幅提高的前提下，我们对接骨胶囊进行了进一步的探索，按照国家药典药品质量标准分析方法验证指导原则，增加了红花和栀子的薄层鉴别，以及柚皮苷的含量测定，增强了接骨胶囊质量的稳定性，为保证人民用药安全提供进一步的保障。

1 薄层色谱法对接骨胶囊中3种中药成分进行鉴别

1.1 仪器和试药

XP205电子天平(METTLER TOLEDO)；硅胶G薄层板(10×20 cm，Merck KgaA，Germany)；KQ-300DE型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；接骨胶囊(生产单位：沂南攀峰骨科医院，批号：20131025，20131029，20131104)；栀子苷对照品(来源：中国食品药品检定研究院，批号：110749-201316)；栀子对照药材(来源：中国食品药品检定研究院，批号：120986-201399)；红花对照药材(来源：中国食品药品检定研究院，批号：120907-201111)；甲醇(德国默克生产)为色谱纯，水为超纯水，其余试剂为分析纯。

1.2 方法和结果

1.2.1 红花的薄层鉴别

取本品内容物1.5 g，加丙酮∶水(80∶20)溶液5 mL，振摇15 min，静置，取上清液，作为供试品溶液。另取红花对照药材0.5 g，加丙酮：水(80：20)溶液5 mL，振摇15 min，静置，取上清液，作为对照药材溶液。照薄层色谱法进行试验，吸取上述两种溶液各5 μL，分别点于同一硅胶G板上，以乙酸乙酯-甲酸-水-甲醇(7∶2∶3∶0.4)为展开剂，展开，取出，晾干，在日光下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相对应的位置上，显相同颜色的斑点。展开系统的分离效果良好，结果见图1。

1、11.红花对照药材；2～4.样品20131025；5～7.样品20131029；8～10.样品20131104温度：14℃，相对湿度：37%；薄层板：Merck KgaA硅胶G板图1 红花的薄层鉴别

1.2.2 栀子的薄层鉴别

取本品内容物1 g，加甲醇∶水(50∶50)溶液10 mL，超声处理40 min，滤过，取滤液作为供试品溶液。另取栀子对照药材1 g，同法制成对照药材溶液。再取栀子苷对照品，加甲醇∶水(50∶50)溶液制成每1 mL含3 mg的溶液，作为对照品溶液[2]。照薄层色谱法试验，吸取上述三种溶液各5 μL，分别点于同一硅胶G板上，以乙酸乙酯-丙酮-甲酸-水(5∶5∶1∶1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加热5 min。在日光下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。展开系统的分离效果良好，结果见图2。

1．栀子苷对照品；2.栀子对照药材；3～5.样品20131025；6～8.样品20131029；9～11.样品20131104温度：17℃，相对湿度：34%；薄层板：Merck KgaA硅胶G板图2 栀子的薄层鉴别

2 接骨胶囊中柚皮苷含量测定

接骨胶囊是由桃仁、红花、骨碎补、土鳖虫、牛膝等21味中药组成，其中骨碎补具有疗伤止痛，补肾强骨功效[3]，在处方中对疗效有比较大的贡献，而柚皮苷为骨碎补和枳壳的共有成分，查阅文献得知柚皮苷在此两种药材中含量较高[4]，因此选用柚皮苷作为该制剂的含量测定指标。

2.1 仪器与试药

安捷伦1260 高效液相色谱仪(美国安捷伦公司)；DZK-D-4型电热恒温水浴锅(北京市永光明医疗仪器有限公司)；XP205电子天平(METTLER TOLEDO)；接骨胶囊(沂南攀峰骨科医院生产，批号：20131025，20131029，20131104)；柚皮苷对照品(来源：中国食品药品检定研究院，批号：110722-201312，含量以94.7%计)；甲醇(德国默克生产)均为色谱纯，水为超纯水，其余试剂为分析纯。

2.2 色谱条件与系统适用性试验

色谱柱：安捷伦SB-C18液相色谱柱(5 μm，4.6×250 mm)；流动相：甲醇-1%冰醋酸(33∶67)；检测波长：283 nm；柱温：30℃。理论板数按柚皮苷峰计算，应不得低于3500。

2.3 对照品溶液的制备

精密称取柚皮苷对照品(来源：中国食品药品检定研究院，批号：110722-201312，含量以94.7%计)12.25 mg，置250 mL容量瓶中，加甲醇使溶解，稀释至刻度，摇匀，即得(浓度为0.04640 mg/mL)。

2.4 供试品溶液的制备

取本品内容物(批号：20131025)适量，用研钵研细，称取约1 g，精密称定，置250 mL具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50 mL，称定其重量，水浴加热回流1 h，放冷至室温，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.5 线性关系的考察

精密吸取2.3项下的柚皮苷对照品溶液(0.04640 mg/mL)2、4、6、8、10μL，注入安捷伦1260高效液相色谱仪，分别测定峰面积。以峰面积积分值为纵坐标，对照品进样量为横坐标，计算线性回归方程：Y=1796.857X-2.7321，相关系数r=0.9997。结果表明，进样量在0.09280～0.4640 μg之间峰面积积分值和进样量呈良好的线性关系。

2.6 仪器精密度试验

精密吸取2.3项下的柚皮苷对照品溶液(0.04640 mg/mL)5μL，注入安捷伦1260高效液相色谱仪，连续进样6次，分别测定其峰面积。结果对照品峰面积积分均值为395.3，RSD值为0.22%(n=6)，表明仪器的精密度良好。

2.7 样品稳定性试验

取本品内容物(批号：20131025)适量，按照2.4项下供试品溶液的制备方法制成供试品溶液。每隔4 h进样一次，每次进样5 μL，测定，共进样7次，分别计算供试品溶液中柚皮苷的峰面积积分值。统计分析供试品中柚皮苷峰面积，积分均值为304.2，RSD值为0.97%。结果表明供试品溶液在24 h内稳定性良好，满足含量测定的需要。

2.8 方法重复性考察

取本品内容物(批号：20131025)适量，照2.4项下供试品溶液的制备方法制成供试品溶液，平行制备6份。分别精密吸取2.3项下的对照品溶液和上述供试品溶液各5 μL，注入安捷伦1260高效液相色谱仪，测定[5]。统计分析供试品中柚皮苷含量，平均值为0.530 mg/粒，RSD值为0.3%。结果表明含量测定方法的重复性良好。

2.9 加样回收率试验

取已知含量的样品(批号：20131025)适量，柚皮苷的含量为0.53 mg/粒，精密称定，共取6份，每份中分别精密加入2.3项下的对照品溶液10 mL，按2.4项下的方法制成加标供试品溶液，按2.2项下的色谱条件进行测定，结果见表1。

表1 柚皮苷加样回收率考察结果

试验结果表明，测定方法的回收率良好。

2.10 专属性试验

阴性对照溶液的制备：取处方中除去骨碎补、枳壳的其他19味药，按处方比例制成阴性对照样品，照2.4项下供试品溶液的制备方法制成阴性对照溶液，即得。

分别精密吸取2.3项下的对照品溶液、2.4项下的供试品溶液和上述阴性对照溶液各5 μL，注入安捷伦1260高效液相色谱仪，测定。分析发现，供试品色谱中，在与对照品色谱峰保留时间相同的位置上，有相对应色谱峰，而阴性对照样品色谱中无相对应色谱峰。结果表明处方中其他药味对供试品中柚皮苷测定无干扰。结果见图3。

图3 RP-HPLC色谱图

2.11 样品测定

按2.4项下供试品溶液的制备方法，对收集到的3批样品进行提取制备，按2.2项下色谱条件进行测定，结果见表2。

表2 测定样品中柚皮苷含量结果

3 讨论

接骨胶囊现行标准中，仅检验显微鉴别以及血竭、当归和川芎的薄层鉴别，而从接骨胶囊的处方组成来看，共有21味中药，现有的检验项目，无法确保该制剂质量的稳定。因此，综合考虑实验的可操作性以及成本，增加红花、栀子2个薄层色谱鉴别项目，以及柚皮苷成分的含量测定，在一定程度上确保了该制剂质量的稳定性。

实验过程中，基于《中国药典》2010年版一部骨碎补的含量测定方法，我们采用水浴加热回流0.5 h、1 h、2 h的方法分别提取实验，结果发现水浴回流0.5 h与1 h结果差异比较明显，而水浴回流1 h与2 h结果无明显差异。因此采用水浴回流1h作为含量测定提取工艺。