逍遥抗癌解郁方对乳腺癌并发抑郁症小鼠海马神经元突触后致密蛋白95表达的影响

韩远山　金狮　王宇红　孟盼　黄会珍　杨琴　赵洪庆　杨蕙　易刚强

摘要：目的  觀察逍遥抗癌解郁方对乳腺癌并发抑郁症（BCRD）小鼠海马神经元突触后致密蛋白95（PSD95）的影响，探讨其对海马组织的可能保护机制。方法  腋下注射4T1炎性乳腺癌细胞联合背部皮下注射皮质酮建立BCRD小鼠模型。随机分为模型组、紫杉醇组、紫杉醇+氟西汀组、逍遥抗癌解郁方组、紫杉醇+逍遥抗癌解郁方组，另取未造模BALB/c小鼠作为正常组。采用悬尾实验和强迫游泳实验检测小鼠抑郁样行为，HE染色观察小鼠海马和乳腺肿瘤病理变化，免疫组化染色和Western blot检测小鼠海马PSD95的表达。结果  与正常组比较，模型组小鼠悬尾实验、强迫游泳实验不动时间显著增加（P<0.01），海马结构损伤明显，PSD95表达水平显著降低（P<0.01）;给予逍遥抗癌解郁方干预后，模型小鼠悬尾实验、强迫游泳实验不动时间明显减少（P<0.05），海马结构损伤得以恢复，PSD95表达显著升高（P<0.01），联合紫杉醇出现肿瘤细胞大面积坏死。结论  逍遥抗癌解郁方可改善BCRD小鼠抑郁症状，有效辅助化疗药物抑制乳腺肿瘤增殖，并通过上调突触可塑性相关蛋白PSD95的表达，保护海马组织。

关键词：逍遥抗癌解郁方;海马;突触后致密蛋白95;乳腺癌并发抑郁症;小鼠

中图分类号：R285.5    文献标识码：A    文章编号：1005-5304（2019）09-0043-05

Effect of Xiaoyao Kangai Jieyu Prescription on Hippocampal Neuron Postsynaptic Density Protein 95 Expression in Mice with Breast Cancer Related Depression

HAN Yuanshan¹， JIN Shi²， WANG Yuhong^2，3， MENG Pan^2，3， HUANG Huizhen²， YANG Qin¹，ZHAO Hongqing^2，3， YANG Hui¹， YI Gangqiang¹

1. Central Laboratory， First Hospital of Hunan University of Chinese Medicine， Changsha 410007， China; 2. Hunan Key Laboratory of Power and Innovative Drugs State Key Laboratory of Ministry Training Bases， Hunan University of Chinese Medicine， Changsha 410208， China; 3. Technology Innovation Center， Hunan University of Chinese Medicine， Changsha 410208， China

Abstract： Objective To study the effect of regulation of Xiaoyao Kangai Jieyu Prescription on hippocampal neuron postsynaptic density protein 95 （PSD95） in mice with breast cancer related depression， and to elucidate its possible mechanism of protect hippocampus. Methods The BCRD mice model was established by axillary injection of 4T1 inflammatory breast cancer cells combined with subcutaneous injection of corticosterone in the back and randomly divided into model group， paclitaxel group， paclitaxel + fluoxetine group， Xiaoyao Kangai Jieyu Prescription group， paclitaxel + Xiaoyao Kangai Jieyu Prescription group. Another unmodeled BALB/c mice were taken as the normal group. Detection of depression-like behavior in mice with tail suspension test and forced swimming test. The pathological structurre changes of hippocampus and breast tumors were observed by HEstaining. The expression of PSD95 in hippocampus of mice was detected by immunohistochemical staining and Western blot. Results Compared with the normal group， the immobility time in the tail suspension test and forced swimming test of the model group significantly increased （P<0.01）， the hippocampal formation was significantly damaged， and the expression level of PSD95 significantly decreased （P<0.01）. After the intervention of Xiaoyao Kangai Jieyu Prescription， the immobility time of the model mice obviously reduced in the tail suspension test and forced swimming test （P<0.05）， the hippocampal structural damage was restored， and the expression level of PSD95 significantly increased （P<0.01）. Combined with paclitaxel， large areas of tumor cell necrosis could be observed. Conclusion Xiaoyao Kangai Jieyu Prescription can improve the depressive symptoms of BCRD mice， effectively assist chemotherapy drugs to inhibit breast tumor proliferation， and protect hippocampus by up-regulating the expression of synaptic plasticity related protein PSD95.

Keywords：Xiaoyao Kang'ai Jieyu Prescription; hippocampus; PSD95; breast cancer related depression; mice

乳腺癌患者诊疗过程中承受着巨大的心理压力，对未来的不确定性和身体形象的担忧易诱发精神疾病的产生，抑郁症是乳腺癌患者最常见的并发症^[1]。临床研究表明，乳腺癌患者抑郁症发生率达10%～25%^[2]，严重影响乳腺癌治疗和预后过程^[3]。因此，研究乳腺癌并发抑郁症发病机制并进行药物干预意义重大。研究表明，乳腺癌患者存在下丘脑-垂体-肾上腺（HPA）轴功能亢进^[4]。HPA轴功能障碍，糖皮质激素代谢紊乱，导致包括神经元损伤、神經营养低下和神经再生障碍在内的海马病理结构改变，是抑郁症发生的重要神经生物学机制^[5]。课题组前期研究发现，乳腺癌并发抑郁症小鼠肿瘤标志物和HPA轴相关指标显著升高，单胺类神经递质明显降低，逍遥抗癌解郁方可有效改善抑郁样指征，辅助紫杉醇延缓乳腺癌并发抑郁症的发展^[6]。本实验观察逍遥抗癌解郁方对乳腺癌并发抑郁症小鼠海马结构及海马神经元突触后致密蛋白95（postsynaptic density protein 95，PSD95）的影响，探讨其对海马组织的可能保护机制。

1  实验材料

1.1  动物

SPF级BALB/c雌性小鼠60只，4～6周龄，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司，动物许可证号SCXK（湘）2013-0004。饲养于温度（24±2）℃、相对湿度50%～60%、明暗周期12 h/12 h环境，自由摄食饮水，适应性喂养5 d。

1.2  药物

逍遥抗癌解郁方（柴胡9 g、夏枯草15 g、菟丝子9 g、枸杞子9 g、重楼9 g、姜黄9 g、人参6 g、贯叶连翘3 g等），饮片均购于湖南中医药大学第一附属医院，并由该院制剂科按比例水煎浓缩;盐酸氟西汀胶囊，法国Patheon，批号7705A;注射用紫杉醇脂质体，深圳万乐制药有限公司，批号11807009。

1.3  主要试剂与仪器

兔抗鼠PSD95（英国Abcam公司），辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG（武汉博士德公司），RIPA裂解液、BCA试剂盒（美国Thermo公司），DAB显色液（北京索莱宝科技有限公司），RPMI培养基、双抗、胰酶（美国HyClone公司），胎牛血清（杭州四季青公司），PBS（北京中杉金桥公司），DMSO、二甲苯、伊红、苏木素、多聚甲醛、无水乙醇（上海蓝润公司）。TS-12A生物组织自动脱水机、BM-Ⅷ 生物组织包埋机、CS-Ⅵ摊片烤片机、冷冻台（孝感市宏业医用仪器有限公司），生物组织切片机（THERMO SCIENTIFIC），光学显微镜（ZEISS），Z32HK型高速冷冻离心（德国HERMLE），凝胶成像分析系统（Bio-Rad）。

2  实验方法

2.1  造模

参照课题组前期研究^[6]，以BALB/c小鼠为造模对象，在其腋下接种1×10⁷个/mL 4T1炎性乳腺癌细胞0.1 mL，制作乳腺癌小鼠模型，接种7 d后，观察其是否成瘤，成瘤即表示造模成功。成模小鼠背部皮下注射皮质酮（30 mg/kg）混悬液，连续21 d，悬尾实验和强迫游泳实验检测抑郁症模型是否建立成功，从而制作乳腺癌并发抑郁症小鼠模型。

2.2  分组和给药

将筛选出的乳腺癌小鼠按自主活动随机分为模型组、紫杉醇组、紫杉醇+氟西汀组、逍遥抗癌解郁方组和紫杉醇+逍遥抗癌解郁方组，另取未造模BALB/c小鼠作为正常组，每组10只。小鼠于皮质酮注射同时给药。紫杉醇组每周腹腔注射1次紫杉醇脂质体（20 mg/kg）;紫杉醇+氟西汀组给予紫杉醇脂质体的同时每日灌胃盐酸氟西汀（2.6 mg/kg）;逍遥抗癌解郁方组每日给予临床等效剂量逍遥抗癌解郁方（19.5 g/kg）;紫杉醇+逍遥抗癌解郁方组给予紫杉醇脂质体的同时每日灌胃逍遥抗癌解郁方;正常组和模型组给予等体积蒸馏水灌胃，共21 d。末次皮质酮注射完成后，进行悬尾实验和强迫游泳实验，完成后脱颈处死，取海马、肿瘤组织，4 ℃冰箱保存待测。

2.3  悬尾实验

小鼠禁食不禁水24 h后，将小鼠尾部部分固定在距离地面60 cm处，使其呈倒挂状态，小鼠之间留有一定距离，并视线彼此隔离，适应30 s后，记录小鼠3 min内四肢不动时间。

2.4  强迫游泳实验

小鼠禁食不禁水24 h后，实验用水缸要求视线隔离，水温为室温，水深要求小鼠自然漂浮状态尾部无法接触缸底，将小鼠头朝下放入水缸中，适应30 s后，记录4 min内小鼠不动时间。

2.5  海马和乳腺肿瘤病理观察

取固定于4%多聚甲醛溶液中海马组织和乳腺肿瘤，常规石蜡包埋，切片，HE染色，封片，镜下观察。

2.6  免疫组化染色检测海马神经元突触后致密蛋白95表达

取固定于4%多聚甲醛溶液中海马组织，石蜡包埋切片，脱蜡至水，3%H₂O₂灭活内源性酶，热抗原修复，封闭后加入兔抗小鼠PSD95一抗（稀释比例1∶100），4 ℃湿盒过夜，滴加辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG二抗，室温孵育20 min，滴加SABC，室温静置20 min，DAB显色，蒸馏水洗涤，苏木素轻度复染，脱水，透明，封片。镜下观察每张玻片上5个不重复视野中阳性细胞，拍照。细胞核呈蓝色，阳性表达区域为棕黄色。

2.7  Western blot检测神经元突触后致密蛋白95表达

取海马组织，加入RIPA裂解液，匀浆后离心取上清液，BCA试剂盒测定蛋白含量。Western blot检测乳腺癌并发抑郁症海马组织PSD95蛋白表达，采用Image J图像分析软件扫描各条带，以目的蛋白和内参蛋白对应灰度值的比值作为蛋白的相对表达量。

3  统计学方法

采用SPSS21.0统计软件进行分析。实验数据以x（—）±s表示。数据符合正态分布用方差分析，两两比较方差齐用LSD法，方差不齐用Dunnett's T3检验。P<0.05表示差异有统计学意义。

4  结果

4.1  悬尾实验和强迫游泳实验结果

与正常组比较，模型组小鼠悬尾实验和强迫游泳实验不动时间明显增加，差异有统计学意义（P<0.01）;与模型组比较，紫杉醇+氟西汀组、逍遥抗癌解郁方组和紫杉醇+逍遥抗癌解郁方组小鼠悬尾实验和强迫游泳实验不动时间明显减少，差异有统计学意义（P<0.01，P<0.05），紫杉醇组强迫游泳不动时间差异无统计学意义（P>0.05）。结果见图1。

4.2  乳腺肿瘤病理变化

模型组小鼠肿瘤细胞排列紧密，坏死少，核质比大，核分裂现象较多，细胞大小形态不一，有较多血管充盈其中;与模型组比较，紫杉醇组、紫杉醇+氟西汀组、紫杉醇+逍遥抗癌解郁方组小鼠肿瘤细胞出现大面积成片坏死，可见明显的蛋白样和细胞碎片，未坏死部分细胞排列疏松，间隙变大，核分裂现象变少。结果见图2。

4.3  海马组织病理变化

正常组海马神经元呈椭圆状，神经元胞体饱满，胞质丰富，细胞核大而圆，排列整齐有序，间隙正常，边缘结构清晰;模型组海马神经元出现萎缩，胞浆浓缩，有空泡样改变，细胞核体积变小或消失，且出现一定程度的深染，甚至出现破裂状态;逍遥抗癌解郁方组和紫杉醇+逍遥抗癌解郁方组海马神经元结构恢复与紫杉醇组和紫杉醇+氟西汀组趋势一致，细胞界限清楚，神经元增多，细胞结构层次分明，细胞核形态无明显差异，只可见少量变性细胞。结果见图3。

4.4  免疫组织化染色结果

与正常组比较，模型组小鼠海马组织PSD95表达与积分光密度值显著降低，差异有统计学意义（P<0.01）;与模型组比较，紫杉醇+氟西汀组、逍遥抗癌解郁方组、紫杉醇+逍遥抗癌解郁方组小鼠海马组织PSD95表达与积分光密度值明显升高，差异有统计学意义（P<0.01，P<0.05）。结果见图4、图5。

4.5  Western blot检测结果

与正常组比较，模型组小鼠海马组织PSD95表达显著降低，差异有统计学意义（P<0.01）;与模型组比较，紫杉醇+氟西汀组、逍遥抗癌解郁方组和紫杉醇+逍遥抗癌解郁方组小鼠海马组织PSD95表达均不同程度升高（P<0.01，P<0.05），与免疫组化结果相一致。结果见图6。

5  讨论

乳腺癌属中医学“乳岩”范畴，抑郁症属中医学“郁证”范畴，情志不畅为乳岩和郁证的共同发病因素。乳岩可并发郁证，郁证又可诱发乳岩加重其病情的进展。因此，乳腺癌并发抑郁症属中医学“乳岩”合并“郁证”范畴，情志失调是其发病的主要因素，与肝、脾、肾、脑密切相关，其病机关键可用“虚、瘀、毒、郁”来概括。逍遥抗癌解郁方由《太平惠民和剂局方》之逍遥散加减，具有疏肝解郁、健脾补肾、化瘀解毒功效。

本实验结果显示，与正常组比较，模型组小鼠悬尾实验和强迫游泳实验不动时间显著增加，提示模型组小鼠存在抑郁样行为;给予逍遥抗癌解郁方干预后，模型小鼠悬尾实验和强迫游泳实验不动时间减少，抑郁症状得到改善。从乳腺肿瘤病理学检查结果可知，逍遥抗癌解郁方可有效辅助化疗药物紫杉醇使肿瘤细胞大面积坏死，并抑制肿瘤增殖。

海马在调节生理、认知和行为方面发挥重要作用，海马功能障碍被认为是至关重要的抑郁症发病机制^[7]。海马突触的结构和分子组成介导其在学习和记忆中的核心作用^[8]。PSD95是突触后膜的蛋白标志物，是突触后膜上最丰富、最重要的骨架蛋白，主要存在于兴奋性谷氨酸能突触内，同时也可作为突触可塑性标志物，参与突触形成与重建，在突触可塑性、控制突触传递、学习记忆等方面具有重要的功能意义，其表达下降意味着突触可塑性损伤^[9]。Adeosun等^[10]研究发现，抑制突触后蛋白PSD95但不抑制突触前蛋白突触素，会导致海马突触后传递功能障碍，从而出现认知功能障碍。Liu等^[11]研究表明，阿魏酸通过增加慢性不可预测轻度应激抑郁小鼠神经营养因子相关的突触蛋白水平发挥抗抑郁作用，在前额皮质和海马中PSD95表达显著上调。本研究中，与正常组比较，模型组小鼠海马结构损伤明显，PSD95表达显著降低，提示乳腺癌并发抑郁症小鼠海马神经元突触可塑性显著损伤;给予逍遥抗癌解郁方干预后，PSD95表达显著升高，海马结构损伤得以恢复。

综上，本研究发现，逍遥抗癌解郁方可改善乳腺癌并发抑郁癥小鼠的抑郁症状，有效辅助化疗药物抑制乳腺肿瘤增殖，并通过上调突触可塑性相关蛋白PSD95的表达，保护海马组织。

参考文献：

[1] SU J A， YEH D C， CHANG C C， et al. Depression and family support in breast cancer patients[J]. Neuropsychiatr Dis Treat，2017， 13（9）：2389-2396.

[2] HENRY N L， STEARNS V， FLOCKHART D A， et al. Drug interactions and pharmacogenomics in the treatment of breast cancer and depression[J]. Am J Psychiatry，2008，165（10）：1251-1255.

[3] CVETKOVI? J. Breast cancer patients' depression prediction by machine learning approach[J]. Cancer Invest，2017，35（8）：569- 572.

[4] JU H B， KANG E C， JEON D W， et al. Associations among plasma stress markers and symptoms of anxiety and depression in patients with breast cancer following surgery[J]. Psychiatry Investig， 2018，15（2）：133-140.

[5] FOURNIER N M， DUMAN R S. Role of vascular endothelial growth factor in adult hippocampal neurogenesis：Implications for the pathophysiology and treatment of depression[J]. Behavioural Brain Research，2012，227（2）：440-449.

[6] 孟盼，黃会珍，杨琴，等.逍遥抗癌解郁方对乳腺癌并发抑郁症模型小鼠抑郁样指征的影响[J].中国中医药信息杂志，2018，25（11）：46-51.

[7] LAW J， IBARGUEN-VARGAS Y， BELZUNG C， et al. Decline of hippocampal stress reactivity and neuronal ensemble coherence in a mouse model of depression[J]. Psychoneuroendocrinology，2016， 67（5）：113-123.

[8] BROADHEAD M J， HORROCKS M H， ZHU F， et al. PSD95 nanoclusters are postsynaptic building blocks in hippocampus circuits[J]. Scientific Reports，2016，6（4）：24626.

[9] 柴继侠，王元元，李徽徽，等.突触后致密蛋白95（PSD95）和突触小泡蛋白在神经元成熟过程中的分布[J].细胞与分子免疫学杂志，2016， 32（12）：1619-1622.

[10] ADEOSUN S O， HOU X， ZHENG B， et al. Human LRRK2 G2019S mutation represses post-synaptic protein PSD95 and causes cognitive impairment in transgenic mice[J]. Neurobiology of Learning and Memory，2017，142（5）：182-189.

[11] LIU Y M， HU C Y， SHEN J D， et al. Elevation of synaptic protein is associated with the antidepressant-like effects of ferulic acid in a chronic model of depression[J]. Physiology & Behavior， 2017，169（2）：184-188.