身痛逐瘀汤对人髓核细胞模型PI3K/Akt信号通路Bad、Caspase-9、GSK-3β表达的影响

陈江　刘志超　张帆　孙旗　袁巧妹　祝永刚　辉灯　郭菲宇　柳根哲

摘要：目的  觀察身痛逐瘀汤对人髓核细胞模型PI3K/Akt信号通路凋亡蛋白Bad、Caspase-9、GSK-3β表达的影响，探讨其可能的作用机制。方法  将人髓核细胞分为6组，分离培养、鉴定及传代后，取第3代细胞进行实验。人髓核细胞加入身痛逐瘀汤药物血清，置于医用恒温静水压压力罐中干预，分别于0.3、1、3 MPa压力下作用2、4、6 h，应用倒置相差显微镜观察人髓核细胞加压前后形态及生长状况，应用透射电子显微镜观察人髓核细胞超微结构，流式细胞术检测人髓核细胞凋亡，采用凝胶电泳迁移法检验人髓核细胞PI3K/Akt信号通路标志蛋白p-Akt的表达，Western blot检测人髓核细胞Bad、Caspase-9、GSK-3β蛋白的表达。结果  同一压力下及作用时间，中药组人髓核细胞形态、超微结构和生长状况较压力组明显变好，其中0.3、1 MPa压力差异显著（P<0.05）;与中药组比较，压力组人髓核细胞凋亡率显著增加（P<0.05）;凝胶电泳迁移显示，人髓核细胞在0.3、1、3 MPa压力下中药组p-Akt表达明显高于压力组（P<0.05）;Western blot结果显示，中药组人髓核细胞Bad、Caspase-9、GSK-3β蛋白表达较压力组明显降低（P<0.05）。结论  身痛逐瘀汤能有效延缓髓核细胞退变，增加细胞活性及减少细胞凋亡，其机制可能与激活PI3K/Akt通路抑制Bad、Caspase-9、GSK-3β蛋白的表达相关。

关键词：身痛逐瘀汤;PI3K/Akt通路;静水压;髓核细胞;细胞凋亡

中图分类号：R285.5    文献标识码：A    文章编号：1005-5304（2019）09-0048-07

Effects of Shentong Zhuyu Decoction on PI3K/Akt Pathway Bad， Caspase-9， GSK-3β Expression of Human Nucleus Pulposus Cells

CHEN Jiang¹， LIU Zhichao²， ZHANG Fan¹， SUN Qi¹， YUAN Qiaomei¹， ZHU Yonggang²，XIAO Huideng²， GUO Feiyu²， LIU Genzhe²

1. Dongzhimen Hospital， Beijing University of Chinese Medicine， Beijing 100700， China; 2. Beijing Traditional Chinese Medicine Hospital， Capital Medical University， Beijing 100010， China

Abstract： Objective To investigate the effects of Shentong Zhuyu Decoction on the exprossion of Bad， Caspase-9， and GSK-3β in nucleus pulposus cells through PI3K/Akt signal pathway and its possible mechanism. Methods Human nucleus pulposus cells were divided into 10 groups. After isolation， culture， identification and passage of six groups of nucleus pulposus cells， the third-generation cells （P3） were taken for experiment. The human nucleus pulposus cells were added into the serum containing Shentong Zhuyu Decoction and intervened in a medical hydrostatic pressure vessel with constant temperature. After 2， 4 and 6 hours of action under 0.3， 1， 3 MPa pressure， inverted phase contrast microscopy was used to observe the morphological changes and growth status of nucleus pulposus cells before and after compression. Transmission electron microscope was used to observe the ultrastructural changes and differences of nucleus pulposus cells in each group. Annexin V-FITC/Propidium Iodide flow cytometry was used to detect apoptotic status of nucleus pulposus cells in each group. Electrophoreticmobility shift assay was used to test the activity of p-Akt in PI3K/Akt pathway of the nucleus pulposus cells of each group， and the expressions of Bad， Caspase-9 and GSK-3β in nucleus pulposus cells were detected by Western blot. Results The morphology， ultrastructure and growth of nucleus pulposus cells in TCM group were better than those in the pressure group under the same pressure and time， and the difference was significant under 0.3 MPa and 1 MPa （P<0.05）. Compared with TCM group， the apoptotic rate of nucleus pulposus cells in the pressure group increased significantly （P<0.05）. Electrophoretic mobility shift assay showed thhat the expression of p-Akt in TCM group was significantly higher than that in the pressure group under 0.3， 1， 3 MPa pressure （P<0.05）. Western blot showed that the expressions of Bad， Caspase-9 and GSK-3β in TCM group decreased as a whole， which was significantly different from that in the pressure group （P<0.05）. Conclusion Shentong Zhuyu Decoction can effectively delay the degeneration of nucleus pulposus cells， increase cell activity and reduce cell apoptosis. Its mechanism may be related to activating PI3K/Akt signal pathway to inhibit the expressions of Bad， Caspase-9 and GSK-3β.

Keywords：Shentong ZhuyuDecoction; PI3K/Akt pathway; hydrostatic pressure; nucleus pulposus cells; apoptosis

椎间盘退行性疾病（intervertebral disc degeneration disease，IVDD）是最多見的骨科疾病，据报道70%～90%人均患过腰痛，年发病率为10%～30%，且呈逐年上升趋势^[1]。流行病学调查显示，IVDD发病人群越来越趋于年轻化，追踪病史分析病因，发现久坐、久站等原因已经逐渐成为主要的致病因素，提示人体脊柱长期受到的静压负荷是引发IVDD的重要因素^[2]。椎间盘（intervertebral disc，IVD）在人体运动时受到压应力在髓核中形成静水压，然后扩散至纤维环，由压应力转变成张应力，因此IVDD与人髓核细胞活力和凋亡密切相关。临床上身痛逐瘀汤治疗IVDD疗效甚佳，因此，本实验在体外静水压加载系统中，以人椎间盘髓核细胞为研究对象，以常压环境为对照，根据前期研究结果设计3种水平的细胞静水压加载负荷（0.3、1、3 MPa），采用身痛逐瘀汤药物血清对髓核细胞培养状态进行干预，检测PI3K/Akt信号通路及其凋亡蛋白的表达，揭示身痛逐瘀汤治疗IVDD的疗效机制及作用靶点。

1  实验材料

1.1  动物

5月龄健康新西兰兔10只，体质量2～4 kg，雌雄不限，中国中医科学院实验动物中心提供。饲养于中国中医科学院基础理论研究所动物房，温度24～26 ℃，相对湿度45%～65%，自由摄食饮水。

1.2  药物及制备

身痛逐瘀汤（秦艽3 g，川芎6 g，桃仁9 g，红花9 g，甘草6 g，羌活3 g，没药6 g，当归9 g，香附3 g，牛膝9 g，川乌3 g，地龙6 g），饮片由北京中医药大学东直门医院中药房提供。药物血清制备：将饮片装入容量1 L的圆底烧瓶中，加20倍水，浸泡4 h，放入套式恒温器煎煮，煮沸1.5 h后，药液纱布过滤，4000×g离心10 min，将上层药液置于滤纸过滤，完毕后倒入500 mL圆底烧瓶中，装入旋转蒸发仪进行蒸发（73 ℃，转速4×g），最后浓缩至20～30 mL，将浸膏倒入培养皿中，放入真空干燥箱（50 ℃）真空干燥2 d，收取固体浸膏，称重，最终药液浓度为0.25 g/mL（7.81 g原药材/mL）。

1.3  主要试剂与仪器

DMEM/F12培养基（GIBCO），胰酶/EDTA（美国Sciencell公司），BCA蛋白浓度测定试剂盒（北京索莱宝公司），丙烯酰胺（VETEC），彩虹180光谱蛋白Maker（北京索莱宝公司），Anti-Caspase 9抗体（欣博盛生物科技有限公司），Anti-GSK-3β抗体（赛信通生物试剂有限公司），Anti-Bad抗体（Abcam），Anti-GAPDH抗体（Abcam），双抗P/S Solution（美国Sciencell公司）。倒置相差显微镜（奥林巴斯，IX50），透射电镜（Hitachi，HF5000），流式细胞仪（美国Beckmam，型号Cytomics FC500），发光凝胶成像系统（英国SYNGENE，型号GeneGnome XRQ），蛋白电泳仪（美国Bio-rad，PowerPac^TM），全自动酶标仪（美BioTek，型号Synergy H1），医用恒温静水压压力罐（北京世纪森朗实验仪器有限公司）。

2  实验方法

2.1  造模

人髓核细胞由Sciencell Research Laboratories提供。复苏细胞时先将髓核细胞从液氮中取出，立即放入37 ℃恒温水浴中，待完全融化后取出，使用移液器将髓核细胞重悬后1000 r/min离心5 min，弃上清液后传代培养髓核细胞，镜下见髓核细胞增殖到约90%瓶底时传代，获得第3代髓核细胞（P3）后，将髓核细胞放入医用恒温静水压压力罐中进行造模，压力设定为0.3、1、3 MPa，分别作用2、4、6 h。

2.2  分组

实验分为单纯压力干预组（压力组）、压力+药物血清组（中药组）共6组，分别为0.3、1、3 MPa压力环境/单纯DMEM培养组，0.3、1、3 MPa压力环境/DMEM+药物血清组。

2.3  给药

按“兔表面积/人体表面积=兔的给药量/人给药量”的换算方法，计算兔给药剂量为3.50 g（/kg·d），为保证血清含药量，尽量调高给药剂量，最终给药剂量为28 g/（kg·d），即原给药剂量的8倍。中药组2只兔分别为3.2、3.8 kg/只，药物180 g溶于130 mL纯水中，以20 mL/（kg·d）灌胃，连续3 d，最后1 d灌胃结束1 h后，耳缘静脉取血，每只家兔取血约50～60 mL，4 ℃静置数小时后，3500 r/min离心15 min，取血清，56 ℃灭活30 min，过滤分装，-80 ℃冰箱保存。课题组前期研究利用MTT比色法筛选出身痛逐瘀汤药物血清最佳给药浓度为15%，药物干预时间为24 h，因此选用15%身痛逐瘀汤药物血清浓度。

2.4  人髓核细胞模型一般形态观察

3代髓核细胞铺片连同培养基一起装入10 mL注射器中，在静水压加载装置中通过注入氮气加压，静水压设定为0.3、1、3 MPa，以模拟人体不同体位下椎间压力环境，每个静水压分别作用2、4、6 h，并通过智能温控装置使容器内温保持在37 ℃。造模结束后，将气体放掉，打开装置盖子，取出注射器，PBS冲洗玻片3遍，4%多聚甲醛固定30 min，利用倒置显微镜观察细胞成长及其形态变化。

2.5  人髓核细胞模型超微结构观察

分别制作压力组和中药组髓核细胞电镜样本，观察静水压加压前后髓核细胞的超微结构。分别为0.3、1、3 MPa，以模拟人体不同体位下椎间压力环境，每个静水压分别作用2、4、6 h。取出细胞玻片，2.5%戊二醛溶液固定，电镜下观察。

2.6  流式细胞术检测人髓核细胞凋亡

人髓核细胞2000 r/min离心5 min，胰酶消化，收集1×10⁵～5×10⁵细胞，添加500 μL Binding Buffer悬浮细胞，加5 μL Annexin V-FITC混匀后，加5 μL Propidium Iodide，混匀室温、避光、反应5～15 min，1 h內流式细胞仪检测。正常活细胞不被Annexin V- FITC和Propidium Iodide染色;凋亡早期细胞仅被AnnexinV-FITC染色，Propidium Iodide染色呈阴性;坏死细胞和凋亡晚期细胞同时被AnnexinV-FITC和Propidium Iodide染色。

2.7  凝胶电泳迁移法检测p-Akt活性

使用核蛋白抽提试剂盒提取细胞核蛋白，按产品说明书进行p-Akt探针标记，采取10 V/cm电压电泳10 min，干燥，X光片压片，检测各组灰度值。

2.8  Western blot检测Bad、Caspase-9、GSK-3β蛋白的表达

①组织蛋白提取：将收集的细胞样本离心，加入RIPA裂解液（含PMSF），离心10 min后，抽吸上清液，-80 ℃冰箱保存。②蛋白含量测定：将标准品及样本PBS稀释后，加入工作液，37 ℃反应30 min，于酶标仪检测OD值并画出标准曲线，计算样本蛋白浓度。③电泳：将分离胶灌入玻璃板间，加入无水乙醇封层后倒出乙醇，然后将浓缩胶倒入分离胶上层，即刻插入梳子，37 ℃等待40 min，取下玻璃板后放入电泳槽，100 V电泳，当样品到浓缩胶与分离胶交界时，改为200 V电泳至终止。④转膜：卸胶、剪胶，放入缓冲液中15 min;剪下PVDF膜，分别浸润在甲醇、超纯水、电转液中;平铺滤纸、PVDF膜、凝胶及滤纸，构成“三明治”模型，固定放入半干转仪器中，25 V恒压转膜30 min。⑤孵育及显影：转膜后，将膜置于一抗溶液，室温水平摇动1 h，4 ℃孵育过夜;次日TBST洗膜10 min×3次，二抗（1︰3000）室温孵育60 min，TBST冲洗10 min×3次。膜上滴加ECL反应液500 μL，30 s后，曝光10 min，成像。

3  统计学方法

采用SPSS18.0统计软件进行分析。研究所得指标均独立重复测定3次，实验数据以x（—）±s表示，2组间比较符合正态分布采用独立t检验，2组间比较不符合正态分布用秩和检验;多组间比较用方差分析。P<0.05表示差异有统计学意义。

4  结果

4.1  光镜观察结果

①细胞体积：0.3、1、3 MPa静水压作用4 h，人髓核细胞体积均缩小，3 MPa静水压作用下细胞体积缩小最明显;②突起：0.3、1、3 MPa静水压作用下细胞突起均变短，3 MPa静水压作用下细胞突起缩短最明显，部分细胞突起不显著，呈皱缩状改变;③相同压力和加载时间，中药组较压力组人髓核细胞数目更多，形态保存更完整，生长状况更好。结果见图1。

4.2  电镜观察结果

人髓核细胞超微结构变化：①人髓核细胞在0.3、1、3 MPa静水压作用4 h后突起均有断裂。②0.3、1 MPa静水压作用下人髓核细胞主级突起完整、次级突起均有断裂;3 MPa静水压作用下人髓核细胞主级突起与次级突起均有断裂。③相同静水压不同作用时间，人髓核细胞超结构无明显变化。④相同压力和作用时间，中药组较压力组人髓核细胞在扫描电镜下形态及超微结构保存更完整，生长状况更好。结果见图2。

4.3  身痛逐瘀汤对人髓核细胞模型凋亡的影响

2组人髓核细胞0.3、1、3 MPa作用2 h细胞凋亡率较低。随着时间的增加，压力组和中药组0.3、1、3 MPa细胞凋亡率上升，其中3 MPa静水压作用2、4、6 h细胞凋亡率较0.3 MPa差异有统计学意义（P<0.05，P<0.01）;2组人髓核细胞3 MPa作用4 h细胞凋亡率明显增加;中药组人髓核细胞0.3 MPa作用2 h后凋亡率最低，压力组人髓核细胞3 MPa压力作用6 h凋亡率最高;2组人髓核细胞3 MPa压力作用4 h和6 h，细胞凋亡率差异不明显（P>0.05）。结果见图3。

4.4  身痛逐瘀汤对人髓核细胞模型PI3K/Akt信号通路相关蛋白表达的影响

0.3 MPa压力作用下随着时间的增加，中药组人髓核细胞p-Akt表达4 h时下降，6 h时明显增加，压力组人髓核细胞p-Akt表达呈上升趋势，但中药组p-Akt水平明显高于压力组，差异有统计学意义（P<0.05）;压力组凋亡蛋白Bad、Caspase-9、GSK-3β的表达随时间增加而升高，加入身痛逐瘀汤药物血清后其表达受到抑制，其中4 h时最明显，差异有统计学意义（P<0.05）。结果见图4。

1 MPa压力作用下，随着时间的增加，压力组人髓核细胞p-Akt表达4 h时明显升高，6 h时降低，整体水平明显下降，差异有统计学意义（P<0.05）;中药组人髓核细胞p-Akt水平随着时间的增加其表达逐渐降低，但中药组p-Akt整体水平高于压力组，差异有统计学意义（P<0.05）;压力组人髓核细胞凋亡蛋白Bad、Caspase-9、GSK-3β的表达随时间增加而升高，而加入身痛逐瘀汤药物血清后其表达受到明显抑制，差异有统计学意义（P<0.05）。见图5。

3 MPa压力作用下，随着时间的增加，压力组人髓核细胞p-Akt表达4 h时明显升高，6 h时明显降低，但整体水平升高，差异有统计学意义（P<0.05）;中药组人髓核细胞p-Akt表达2 h时最高，后随着时间增加其表达明显下降，差异有统计学意义（P<0.05）;凋亡蛋白Bad、Caspase-9、GSK-3β的表达随时间增加而升高，加入身痛逐瘀汤药物血清后其表达受到明显抑制，差异有统计学意义（P<0.05）。见图6。

5  讨论

PI3K/Akt通路在调控椎间盘髓核细胞凋亡方面发挥着重要作用。Deng等^[3]研究发现，淫羊藿苷通过PI3K/Akt途径抑制大鼠髓核间盘细胞H₂O₂诱导的凋亡，其机制是淫羊藿苷显著降低了H₂O₂诱导的细胞凋亡和细胞内活性氧，上调p-Akt和Bcl-2表达，下调Caspase-3和Bax表达。Liu等^[4]研究发现，椎间盘受到应力刺激时，髓核细胞可激活PI3K/Akt信号通路抑制促凋亡Bcl-2家族成员Bad、Caspase-9、GSK-3β等凋亡转录因子的转录而起到抑制髓核细胞凋亡的作用。

研究表明，当过高的压力加载时，IVD会发生形变，且IVD内的静水压会明显增加，导致IVD内水分外移，继而细胞外基质分解加快，IVD内环境趋于恶化，诱发IVDD^[5-6]。反之IVD内静水压缺失同样会导致IVD组织内蛋白聚糖的表达量显著降低，这种作用与压力的强度和作用时间相关^[7-8]。这些结果同国外学者的研究结果^[9-12]一致。表明静水压力学因素与IVD髓核细胞的凋亡和细胞外基质代谢的影响最为密切^[13-14]。

中医学认为，腰痹常由气血瘀滞引起，现代医学提出腰腿痛的根本原因是炎性因子刺激或神经根受压后水肿所致^[15]。北京中医药大学东直门医院名老中医孙呈祥教授总结治疗临床腰腿痛的核心是行气活血，关键是祛瘀通络，并以中医经典方剂身痛逐瘀汤临床辨证治疗IVDD疗效较好^[16]，方中秦艽、羌活祛风除湿，没药、香附行气血、止疼痛，桃仁、红花、当归、川芎活血祛瘀，牛膝、地龙疏通经络以利关节，甘草调和诸药，全方共奏活血祛瘀、祛风除湿、通痹止痛之效。国内有关身痛逐瘀汤治疗IVDD的相关临床研究报道显示该方疗效显著^[17-19]。

本研究以身痛逐瘀汤药物血清在体外静水压环境下干预人椎间盘髓核细胞，表明中药药物血清对髓核细胞活力、形态和超微结构具有保护作用，降低髓核细胞凋亡率。Western blot检测加入身痛逐瘀汤药物血清后人髓核细胞p-Akt表达升高，凋亡蛋白Bad、Caspase-9、GSK-3β表达降低。通过与压力组对比发现，随着椎间盘静水压的增加身痛逐瘀汤药物血清后虽不能逆转间盘退变趋势，但明显抑制了这一进程，说明身痛逐瘀汤可能通过上调PI3K/Akt通路的表达延缓人髓核细胞凋亡，从而减缓椎间盘退变。

综上所述，体外培养髓核细胞存在时间-压力依赖关系，作用时间延长及压力增大均可导致髓核退变;在相对短时间内（6 h内），压力负荷是导致髓核细胞凋亡的主要因素，低静水压环境（0.3、1 MPa）下，髓核细胞活力随时间变化不明显，而在高静水压（3 MPa）环境下，随时间增加，髓核细胞活力显著下降;身痛逐瘀汤可能通过激活PI3K/Akt信号通路，进而调控通路相关分子蛋白的表达，延缓IVD的退变，其作用机制可能与抑制Bad、Caspase-9、GSK-3β蛋白表達相关。

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