糖痛方对糖尿病神经病变大鼠坐骨神经自噬相关蛋白Beclin-1和LC3Ⅱ表达的影响

王明欣　田宇　朱晓云　王洪武　白文山　李鸣镝

摘要：目的  觀察糖痛方对糖尿病周围神经病变（DPN）大鼠坐骨神经自噬相关蛋白Beclin-1和LC3Ⅱ表达的影响，初步探讨其作用机制。方法  雄性SD大鼠75只，随机选取15只为正常组，其余60只采用2%链脲佐菌素诱导制作糖尿病大鼠模型，造模成功4周后，结合缺血再灌注制备DPN模型，成模大鼠随机分为模型组和糖痛方低、中、高剂量组，每组15只，糖痛方低、中、高剂量组分别按成人6.25、12.5、25倍剂量给药，正常组和模型组给予等量蒸馏水灌胃，每日1次，灌胃8周，Western blot和实时荧光定量PCR分别检测大鼠Beclin-1、LC3Ⅱ蛋白和mRNA的表达，透射电镜观察坐骨神经超微结构。结果  与正常组比较，模型组大鼠Beclin-1、LC3Ⅱ蛋白和mRNA表达均升高，髓鞘肿胀、变性，板层分离;与模型组比较，糖痛方各剂量组大鼠Beclin-1和LC3Ⅱ蛋白和mRNA表达呈下降趋势，以糖痛方中、高剂量组降低明显，髓鞘变性程度减轻。结论  糖痛方可能通过抑制模型大鼠过度自噬，发挥对DPN大鼠的治疗作用。

关键词：糖痛方;自噬;糖尿病周围神经病变;大鼠

中图分类号：R285.5    文献标识码：A    文章编号：1005-5304（2019）09-0065-04

Effects of Tangtong Prescription on Expressions of Beclin-1 and LC3Ⅱ in Diabetic Neuropathy Rats

WANG Mingxin¹， TIAN Yu²， ZHU Xiaoyun¹， WANG Hongwu²， BAi Wenshan¹， LI Mingdi¹

1. Guanganmen Hospital， China Academy of Chinese Medical Sciences， Beijing 100053， China; 2. Tianjin University of Traditional Chinese Medicine， Tianjin 300193， China

Abstract： Objective To observe the effects of Tangtong Prescription on beclin-1 and LC3Ⅱ of autophagy related proteins in sciatic nerve of diabetic peripheral neuropathy rats; To preliminarily investigate its mechanism of action. Methods Seventy-five male SD rats were randomly selected， 15 for normal group， and other 60 rats were treated with intraperitoneal injection of STZ to build type 2 diabetic nice model. 4 weeks after modeling， diabetic peripheral neuropathy （DPN） model was prepared by combining with ischemia-reperfusion preparation of， the model of DPN rats were randomly divided into model group， and Tangtong Prescription low-， medium- and high-dosage groups， with 15 cases in each group. Tangtong Prescription low-， medium- and high-dosage groups were given medicine as 6.25， 12.5， 25 times of adult doses. The normal group and the model group were given the same amount of distilled water for gavage， once a day. After gavage for 8 weeks， Western blot and real-time fluorescent quantitative PCR were used to detect the expressions of Beclin-1 and LC3Ⅱ proteins and mRNA， and the ultrastructure of sciatic nerve was observed by transmission electron microscope. Results Compared with the normal group， expressions of Beclin-1 and LC3Ⅱ protein and mRNA in the model group increased， with myelin sheath swelling and degeneration， and lamellar separation. Compared with the model group， expressions of beclin-1 and LC3Ⅱ protein and mRNA showed a downward trend， and myelin degeneration was significantly reduced in Tangtong Prescription medium- and high-dosage groups. Conclusion Tangtong Prescription may play a therapeutic role in DPN rats by inhibiting excessive autophagy in model rats.

Keywords： Tangtong Prescription; autophagy; diabetic peripheral neuropathy; rats

糖尿病周围神经病变（diabetic peripheral neuropathy，DPN）是糖尿病最常见的慢性并发症之一，该病发病机制复杂，迄今对DPN患者尚缺乏有效的治疗方法^[1]。糖痛方是中国中医科学院广安门医院林兰教授治疗DPN的经验方，多年臨床实践表明其临床疗效较好^[2-3]。课题组前期研究表明，糖痛方可明显减少细胞间黏附分子-1、肿瘤坏死因子-α、过氧化物酶的高表达，并通过降低雪旺细胞凋亡率和Caspase-3、Caspase-9蛋白和mRNA的表达，提高Bcl-2蛋白及mRNA的表达，显示出其具有抑制细胞凋亡、减弱神经组织的炎症反应，提高DPN大鼠模型坐骨神经传导速度的作用^[4-8]。为进一步探讨糖痛方治疗DPN的可能机制，本实验观察糖痛方对DPN大鼠坐骨神经自噬相关蛋白Beclin-1和LC3Ⅱ表达的影响，为临床应用提供一定的实验依据。

1  实验材料

1.1  动物

SPF级雄性SD大鼠75只，体质量160～180 g，北京维通利华实验动物技术有限公司提供，动物许可号SCXK（京）2016-0011;饲养于中国中医科学院广安门医院SPF级动物房，温度18～25 ℃，相对湿度50%～80%，明暗周期12 h，自由摄食饮水。

1.2  药物

糖痛方（黄芪30 g，桂枝10 g，白芍10 g，细辛3 g，土鳖虫10 g，姜黄15 g，川芎10 g），饮片购自中国中医科学院广安门医院中药房，经水煎取汁浓缩，制成浓度为2.64 g/mL药液。精蛋白锌胰岛素注射液，江苏万邦生化医药公司，规格400 IU/10 mL，批号030814。

1.3  主要试剂与仪器

链脲佐菌素（美国Sigma公司），水合氯醛（国药集团化学试剂有限公司），磷酸盐缓冲液（北京赛默飞世尔公司），注射用青霉素钠（华北制药股份有限公司），4%多聚甲醛溶液（北京索莱宝科技有限公司），HRP标记羊抗兔IgG（H+L，美国Jackson公司），HRP标记羊抗鼠IgG（H+L，美国Jackson公司BCA蛋白检测试剂盒（北京康为世纪生物科技有限公司，批号02912E），HiFiScript cDNA第一链合成试剂盒（北京康为世纪生物科技有限公司，批号CW2569），QPCR试剂盒（美国Biosystems公司KK4601）。罗氏卓越型血糖仪（美国罗氏诊断公司），高速冷冻离心机（德国Hettich公司），DM-300生物显微镜（德国Leica公司），JEM-1400透射电子显微镜（日本电子株式会社），JY300C电泳仪（北京君意东方电泳设备有限公司），ChampGel 5000凝胶成像仪（北京赛智创业科技有限公司）。

2  实验方法

2.1  糖尿病模型制作

75只SD大鼠适应性饲养1周，随机选择15只作为正常组，其余60只大鼠禁食不禁水12 h，次日使用pH 4.2柠檬酸盐缓冲液配制浓度为2%链脲佐菌素溶液，按60 mg/kg体质量腹腔注射，72 h后血糖仪测量大鼠尾尖血糖，以持续随机血糖>16.7 mmol/L作为糖尿病大鼠成模标准。正常组大鼠注射等量柠檬酸盐缓冲液。造模期间，每2周测量1次尾尖血糖;对随机血糖<16.7 mmol/L大鼠予以剔除;对随机血糖>27 mmol/L大鼠，根据其血糖水平，予精蛋白锌胰岛素注射液1～4 U皮下注射，每日1次，维持血糖在19.4～25.0 mmol/L。

2.2  糖尿病周围神经病变模型制作

糖尿病大鼠饲养4周后，将10 g水合氯醛用无菌水配制成100 mL溶液，锡箔纸包裹避光保存。参照文献[5]方法造模，按4 mL/kg体质量腹腔注射麻醉大鼠，仰卧位固定鼠板上，消毒备皮后，沿右侧腹股沟韧带剪开长约2 cm切口，钝性剥离股动脉，使用动脉夹于腹股沟水平处夹闭股动脉，再沿腹壁正中线切开长3 cm切口，钝性剥离腹主动脉和右侧髂总动脉，使用动脉夹先后于髂动脉分叉处下1 cm处夹闭右侧髂总动脉，于髂腰动脉水平下0.5 cm处夹闭腹主动脉。盐水纱布保护切口，使用红外线灯使右后肢体温保持35 ℃。3 h后恢复供血，逐层缝合肌肉、皮肤。术后大鼠腹腔注射8万U/只青霉素钠，连续3 d。正常组大鼠不予处理。

2.3  分组和给药

术后7 d待大鼠伤口愈合后分组、给药。60只DPN模型大鼠随机分为模型组和糖痛方低、中、高剂量组，每组15只。糖痛方低、中、高剂量组分别按每日成人剂量6.25倍（9.17 g/kg）、12.5倍（18.33 g/kg）、25倍（36.67 g/kg）灌胃给药，正常组和模型组给予等量蒸馏水灌胃。给药体积均为1 mL/100 g，每日1次，连续8周。

2.4  检测指标

2.4.1  Western blot检测Beclin-1和LC3Ⅱ蛋白表达

大鼠腹腔注射10%水合氯醛麻醉，截取右侧坐骨神经，RIPA蛋白裂解液匀浆，冰上孵育20 min，4 ℃、13 000 r/min离心20 min，取上清液。按照BCA蛋白定量试剂盒使用说明书进行操作，测定蛋白浓度。配制15%分离胶，浓缩胶浓度为5%，上样，浓缩压恒压90 V，分离胶恒压120 V，300 mA恒流转膜60 min，将膜浸入5%BSA-TBST中，室温放置1 h。用5%BSA- TBST稀释一抗，4 ℃水平摇床孵育过夜。次日洗膜，TBST冲洗3次×10 min。用封闭液稀释HPR标记的二抗，室温孵育40 min，TBST冲洗3次×10 min，ECL曝光。

2.4.2  qRT-PCR检测Beclin-1和LC3Ⅱ基因表达

按Trizol试剂盒说明提取总RNA，1.2%琼脂糖凝胶电泳，反转录按HiFiScript cDNA第一链合成试剂盒说明书进行操作。反应体系：SYBR FAST QPCR Kit Master Mix（2×）5 μL，上游引物F（10 μmol/L）0.2 μL，下游引物R（10 μmol/L）0.2 μL，cDNA模版1 μL。PCR扩增条件：95 ℃、3 min;95 ℃、3 s;60 ℃、20 s，40个循环。引物设计见表1。

2.4.3  透射电镜观察坐骨神经超微结构

大鼠腹腔注射10%水合氯醛麻醉，截取右侧坐骨神经。取1 mm³左右2.5%戊二醛固定，1%锇酸后固定，乙醇丙酮梯度脱水，Epon812包埋，超薄切片，厚度为50～70 nm，乙酸双氧铀和枸橼酸铅双染色，透射电镜观察有髓鞘神经纤维脱髓鞘及细胞质的病理改变并摄片，观察有无损伤的细胞器（如线粒体的肿胀变性、自噬体等）。

3  统计学方法

采用SPSS 22.0统计软件进行分析。计量资料以x（—）±s表示，组间比较釆用方差分析，组间两两比较用LSD法。P<0.05表示差异有统计学意义。

4  结果

4.1  糖痛方对模型大鼠坐骨神经Beclin-1和LC3Ⅱ蛋白表达的影响

与正常组比较，模型组大鼠Beclin-1蛋白表达水平升高，差异无统计学意义（P>0.05），LC3Ⅱ蛋白表达水平显著上升，差异有统计学意义（P<0.01）;与模型组比较，糖痛方各剂量组大鼠Beclin-1和LC3Ⅱ蛋白表达均有下降趋势，差异无统计学意义（P>0.05）。结果见图1、表2。

4.2  糖痛方对模型大鼠坐骨神经Beclin-1和LC3Ⅱ基因表达的影响

与正常组比较，模型组大鼠Beclin-1和LC3Ⅱ mRNA表达明显升高，差异有统计学意义（P<0.05，P<0.01）;与模型组比较，糖痛方各剂量组大鼠Beclin-1和LC3Ⅱ mRNA表达降低，其中糖痛方中、高剂量组Beclin-1明显降低，差异有统计学意义（P<0.01）。结果见表3。

4.3  超微结构观察结果

正常组大鼠坐骨神经髓鞘完整，髓鞘板层呈同心圆层状排列，无变形、萎缩、分离;雪旺细胞及细胞核呈卵圆形，核仁明显，染色质均匀;模型组大鼠坐骨神经髓鞘肿胀、变性，可见到板层分离，雪旺细胞细胞核为卵圆形，胞浆中可见空泡变性;糖痛方各剂量组大鼠坐骨神经髓鞘变性不同程度减轻，糖痛方低剂量组可见坐骨神经髓鞘变性和胞浆中空泡变性，但髓鞘板层排列整齐;糖痛方中剂量组坐骨神经髓鞘变性、轻微崩解，板层结构较完整，细胞核为卵圆形，胞质清晰、均匀;糖痛方高剂量组坐骨神经髓鞘肿胀，有部分崩解，但未见板层分离。结果见图2。

5  讨论

DPN以四肢远端对称性感觉和运动障碍，运动、感觉神经传导速度减慢及髓鞘和轴突变性为特点。其病理显示节段性脱髓鞘改变与雪旺细胞损害，同时伴有明显的神经内膜微血管病。自噬是真核细胞通过降解自身细胞器和细胞质实现“自我消化”的过程^[9-10]，被称为Ⅱ型程序性细胞死亡。凋亡与自噬在生化代谢途径及形态学方面都有显著区别。有研究显示，自噬可保护细胞免于发生凋亡^[11]。

Beclin-1是酵母自噬相关基因Atg6/Vps30的哺乳动物同源基因，参与自噬体形成的启动过程，在自噬泡形成过程中起重要作用，其表达与自噬的发生正相关。LC3是自噬的标志性蛋白，真核细胞中有2种LC3：位于胞浆内LC3-Ⅰ在自噬相关酶的催化下发生反应，与自噬体膜表面的磷脂酰乙醇胺结合，转化为LC3-Ⅱ，LC3-Ⅱ位于自噬体膜上，其表达与自噬体的数量呈正相关。

本研究采用课题组前期建立的DPN模型^[5]。研究表明，当脑组织发生缺血再灌注损伤时，自噬水平上调^[12-13]。本實验结果显示，与正常组比较，模型组大鼠坐骨神经Beclin-1和LC3Ⅱ的mRNA表达明显升高，糖痛方干预后，Beclin-1和LC3Ⅱ mRNA表达呈下降趋势。Beclin-1和LC3Ⅱ mRNA表达升高提示自噬活动旺盛，其水平回降提示自噬活动趋于平稳。自噬是把双刃剑，既可在生理情况下对细胞内残损的细胞器、错误折叠的蛋白质进行降解重吸收，保证细胞内环境稳定，提高能量利用率，减少细胞的凋亡;又可在病理性亢进下过分激活，导致整个细胞被溶解死亡^[14-16]。本实验结果显示，与自噬呈正相关性的Beclin-1及LC3Ⅱ，在高血糖环境下大鼠坐骨神经中含量显著升高，糖痛方干预后，可降至接近正常水平，表明糖痛方能调节细胞自噬活动。

综上所述，糖痛方可通过调节细胞自噬，提高细胞内“垃圾”代谢的效率，抑制细胞凋亡，从而起到治疗DPN及其并发症的作用。

参考文献：

[1] 饶潇潇，姚广涛，文小平.中药干预糖尿病周围神经病变作用机制研究进展[J].中国中医药信息杂志，2017，24（4）：130-133.

[2] 李鸣镝，林兰，孙书臣，等.中药糖痛方外洗治疗糖尿病周围神经病变的临床观察[J].中国康复理论与实践，2009，15（6）：553-555.

[3] 玉山江，林兰.糖痛方内服外洗合弥可保治疗糖尿病周围血管神经病变临床研究[J].中国中医药信息杂志，2003，10（3）：13-15.

[4] 黄达.糖痛方治疗糖尿病血管神经病变的临床与实验研究[D].北京：中国中医科学院，2014.

[5] 黄达，李鸣镝，郑亚琳，等.糖痛方对糖尿病大鼠肢体缺血再灌注后肝肾ICAM-1和MPO表达的影响[J].医学研究杂志，2014，43（8）：37-40.

[6] 郑亚琳，李鸣镝，林兰.糖痛方对施万细胞凋亡及Bcl-2、caspase-3、caspase-9表达的影响[J].医学研究杂志，2014，43（11）：39-42.

[7] 林兰，郑亚琳，李鸣镝，等.糖痛方及其有效成分对高糖培养的施万细胞增殖的影响[J].医学研究杂志，2013，42（9）：44-47.

[8] 劉晓星，朱晓云，韦茂英，等.糖痛方对高糖诱导RSC96细胞凋亡与增殖的影响[J].中国中医药信息杂志，2017，24（10）：49-52.

[9] CHATURVEDI A， PIERCE S K. Autophagy in immune cell regulation and dysregulation[J]. Current Allergy and Asthma Reports，2009， 9（5）：341-346.

[10] 任安立，李靖凯，周冬冬.程序化细胞死亡因子5对缺氧/复氧诱导的心肌细胞凋亡和自噬的影响及机制[J].中国病理生理杂志，2017，33（2）：251-256.

[11] KOVACS A L， HONG Z. Role of autophagy in Caenorhabditis elegans[J]. Febs Letters，2010，584：1335-1341.

[12] 朱丽娟，罗建云，张安平，等.当归挥发油通过抑制自噬减轻拟缺血再灌注神经细胞损伤[J].中药药理与临床，2017，33（4）：56-59.

[13] ZHAO Y N，GUO X F，LI J M，et al. mTOR/autophagy pathway in the hippocampus of rats suffering intermittent hypoxia preconditioning and global cerebral ischemia-reperfusion[J]. Oncotarget，2017，8（14）：23353-23359.

[14] 孙晓伟，高营，王新宇，等.针刺对脑缺血再灌注损伤神经细胞自噬影响的研究概况[J].中医药信息，2019，36（2）：122-126.

[15] CHEN Y， KLIONSKY D. The regulation of autophagy-unanswered questions[J]. Joural of Cell Science，2011，124（2）：161-170.

[16] 项冰倩，高慧，CHEN J H，等.RXR介导的自噬通路在大鼠肺缺血/再灌注损伤中的调控作用[J].中国病理生理杂志，2018，34（11）：2054-2061.