不同浓度乙醇提取丹参中12种成分比较研究

孙锦　林力　彭勍　张鹏　任钧国　刘建勋

摘要：目的  建立HPLC同時测定丹参中9种水溶性成分和3种脂溶性成分含量的方法，以不同浓度乙醇为代表，探讨溶剂极性对丹参有效成分溶出的影响。方法  采用Agilent Extend-C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），以乙腈-0.1%磷酸溶液为流动相，梯度洗脱，流速0.8 mL/min，柱温25 ℃，检测波长280 nm，进样量10 μL，考察不同浓度乙醇（0%、20%、40%、60%、80%、95%）提取的丹参中12种成分的含量。结果  在95 min内，丹参中12种成分可实现完全分离，在线性范围内质量浓度与峰面积具有良好的线性关系（r>0.998），平均回收率为95.28%～104.97%，RSD<4.58%。不同浓度乙醇对丹参中12种成分含量影响不同，随溶剂极性降低，水溶性成分总量呈先升高后降低的趋势，脂溶性成分持续升高。结论  本研究建立的方法专属性好，灵敏度高，定量准确，可用于同时测定丹参中9种水溶性成分和3种脂溶性成分的含量。不同浓度乙醇对丹参中12种指标性成分的溶出有很大影响。

关键词：丹参;乙醇浓度;水溶性成分;脂溶性成分

中图分类号：R284.1    文献标识码：A    文章编号：1005-5304（2019）09-0089-05

Comparative Study on Extraction of 12 Components from Salviae Miltiorrhizae Radix et Rhizoma with Different Concentrations of Ethanol

SUN Jin， LIN Li， PENG Qing， ZHANG Peng， REN Junguo， LIU Jianxun

Beijing Key Laboratory of Pharmacology of Chinese Materia Medica， Institute of Basic Medical Sciences of Xiyuan Hospital， China Academy of Chinese Medical Sciences， Beijing 100091， China

    Abstract： Objective To establish an HPLC method for the simultaneous determination of nine hydrophilic compounds and three lipophilic compounds in Salviae Miltiorrhizae Radix et Rhizoma; To discuss the effects of solvent polarity difference on the dissolution of active components in Salviae Miltiorrhizae Radix et Rhizoma represented by different concentrations of ethanol. Methods The HPLC separation was performed on an Agilent Extend-C18 column （4.6 mm × 250 mm， 5 μm）， eluted with the mobile phase of acetonitrile-0.1% phosphoric acid solution. The flow rate was 0.8 mL/min; the column temperature was 25 ℃; the detection wavelength was 280 nm; the injection volume was 10 μL. The contents of 12 components in Salviae Miltiorrhizae Radix et Rhizoma extracted from different concentrations of ethanol （0%， 20%， 40%， 60%， 80%， 95%） were investigated. Results The complete separation was obtained within 95 minutes for the 12 components. There was a good linear relationship between concentration and peak area in the linear range （r>0.998）. The average recoveries were 95.28%–104.97% and RSD were less than 4.58%. Different concentrations of ethanol had different influence on the contents of 12 components. The total amount of water-soluble components increased first and then decreased with the decrease of the polarity of the solvent， and the fat-soluble component continued to rise. Conclusion The method has good specificity， high sensitivity and accurate quantitative， which can be used for simultaneous determination of nine hydrophilic compounds and three lipophilic compounds in Salviae Miltiorrhizae Radix et Rhizoma， and different concentrations of ethanol have great influence on the dissolution of the 12 components.

    Keywords： Salviae Miltiorrhizae Radix et Rhizoma; concentrations of ethanol; water-soluble components; fat-soluble components

丹参为唇形科植物丹参Salvia miltiorrhiza Bge.的干燥根及根茎，始载于《神农本草经》，具有活血祛瘀、通经止痛、清心除烦、凉血消痈功效^[1]。目前研究发现，丹参中的活性成分主要包括以酚酸类为主的水溶性成分和以二萜醌类为主的脂溶性成分^[2]。现代药理研究表明，丹参中的这两类成分都具有扩张冠状动脉、防止心肌缺血和心肌梗死、降低心肌耗氧量等作用^[3]。

通过对丹参水溶性成分和脂溶性成分进行测定来评价丹参及其制剂质量多有报道，然而大多局限于以丹酚酸B和丹参酮ⅡA为指标性成分^[4-8]，且由于丹酚酸类化合物的不稳定性^[9-11]，水溶性成分与脂溶性成分性质差异太大，很少有同时测定多种水溶性和脂溶性成分的报道。同时针对相同适应症的中药制剂研究很多，提取工艺也多种多样^[12-15]，但迄今尚未见溶剂极性差异对丹参成分溶出影响的报道。本试验建立同时测定丹参9种水溶性成分（丹参素、原儿茶醛、咖啡酸、阿魏酸、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B、丹酚酸A和丹酚酸C）和3种脂溶性成分（隐丹参酮、丹参酮Ⅰ和丹参酮ⅡA）的定量分析方法，并以这12种成分为指标，探讨不同浓度乙醇对丹参化学成分溶出量的影响，以期为丹参的质量控制及制剂工艺筛选提供参考。

1  仪器与试药

Agilent1200型高效液相色谱仪，美国安捷伦公司;Agilent Extend-C18色谱柱（4. 6 mm×250 mm，5 μm），美国安捷伦公司;METTLER AE240型电子分析天平，瑞士梅特勒-托利多公司;KQ-300型超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司;Milli-Q超纯水仪，美国MILLIPORE公司;MIKRO-22R台式离心机，德国Hettich公司;FW177中草药粉碎机，天津市泰斯特仪器有限公司。

对照品丹参素钠（批号110855-201614）、阿魏酸（批号110773-200611）、原儿茶醛（批号110810- 2005006）、丹酚酸B（批号111562-201716）、丹参酮ⅡA（批号110766-200619），中国食品药品检定研究院;对照品紫草酸（批号Y30S7H22269）、隐丹参酮（批号H1208X45502）、丹参酮Ⅰ（批号P28D8F51847），上海源叶生物科技有限公司;对照品迷迭香酸（批号20131204）、丹酚酸C（批号130413），天津一方科技有限公司;对照品咖啡酸（批号2681/18660），上海诗丹德生物技术有限公司;丹酚酸A，本实验室自制。除丹酚酸B（纯度94.1%）、丹酚酸A（纯度92%）外，其余对照品纯度均大于98%。丹参饮片（批号1711011）购自河北百草康神药业有限公司，为唇形科植物丹参Salvia miltiorrhiza Bge.的干燥根及根茎。乙腈、磷酸为色谱纯（美国Fisher公司），水为娃哈哈纯净水（杭州娃哈哈集团有限公司），乙醇为95%医用酒精（北京鸿志伟达工贸有限公司）。

2  方法与结果

2.1  色谱条件

色譜柱：Agilent Extend-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）;流动相：乙腈（A）-0.1%磷酸（B），梯度洗脱（0～5 min，10%A;5～25 min，10%A→20%A;25～80 min，20%A→70%A;80～90 min，70%A→90%A）;检测波长：280 nm;柱温：25 ℃;流速：0.8 mL/min;进样量：10 μL。色谱图见图1。

2.2  对照品贮备溶液制备

精密称取丹参素钠、原儿茶醛、咖啡酸、阿魏酸、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B、丹酚酸A、丹酚酸C、隐丹参酮、丹参酮Ⅰ、丹参酮ⅡA对照品适量，加甲醇制成浓度分别为5.649、0.745、0.798、0.757、1.521、1.678、7.864、2.139、1.010、2.099、0.886、5.281 mg/mL的对照品贮备溶液，置于4 ℃冰箱避光保存，备用。

2.3  供试品溶液制备

取丹参粉末1 g（过65目筛），精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入不同浓度乙醇（0%、20%、40%、60%、80%、95%）40 mL，称定质量，超声处理（功率300 W，频率40 kHz）60 min，再称定质量，用溶媒补足减失的质量，摇匀，4 ℃、12 000 r/min离心10 min，取上清液，即得。

2.4  线性关系考察

精密量取各对照品贮备液各100 μL，混匀，制成混合对照品溶液，依次等比稀释2、4、8、16、32、64、128倍，制成对照品溶液。按“2.1”项下色谱条件分别进样，以对照品进样量为横坐标，相应的峰面积积分值为纵坐标，绘制标准曲线，得到各待测成分的线性回归方程和线性范围，见表1。

2.5  方法学考察

2.5.1  精密度试验

精密吸取上述混合对照品溶液10 μL，在上述色谱条件下重复进样6次，测得丹参素钠、原儿茶醛、咖啡酸、阿魏酸、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸 B、丹酚酸A、丹酚酸 C、隐丹参酮、丹参酮Ⅰ、丹参酮ⅡA的峰面积积分值RSD为0.12%～1.45%，表明仪器精密度良好。

2.5.2  稳定性试验

精密吸取同一供试品溶液10 μL，分别于制备后0、2、4、8、12、16、20、24 h注入色谱仪进行分析，计算各成分峰面积积分值的RSD为0.23%～4.97%，结果表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.5.3  重复性试验

取同一份丹参粉末，精密称定，按“2.3”项下方法平行制备6份供试品溶液（60%乙醇），按上述色谱条件进样测定，计算丹参素钠、原儿茶醛、咖啡酸、阿魏酸、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B、丹酚酸A、丹酚酸C、隐丹参酮、丹参酮Ⅰ、丹参酮ⅡA的平均含量分别为0.77、0.022、0.090、0.025、1.00、2.15、23.28、0.41、0.98、0.72、0.29、1.04 mg/g，RSD为1.07%～4.58%，表明该方法重复性良好。

2.5.4  加样回收率试验

取已知含量的丹参粉末6份，每份约0.025 g，置2 mL量瓶中，精密加入含丹参素钠17.09 μg/mL、原儿茶醛1.44 μg/mL、咖啡酸2.55 μg/mL、阿魏酸0.64 μg/mL、迷迭香酸44.23 μg/mL、紫草酸62.79 μg/mL、丹酚酸B 571.35 μg/mL、丹酚酸A 19.91 μg/mL、丹酚酸C 18.19 μg/mL、隐丹参酮21.83 μg/mL、丹参酮Ⅰ12.64 μg/mL、丹参酮ⅡA 29.82 μg/mL的混合对照品溶液1 mL，按“2.3”项下方法制备供试溶液，按“2.1”项下色谱条件进行分析，计算加样回收率及RSD，结果表明本方法回收率良好。

2.6  样品含量测定

按“2.3”项下方法制备同一样品不同浓度乙醇提取的供试品溶液，在上述色谱条件下测定，用外标法测定丹参素钠、原儿茶醛、咖啡酸、阿魏酸、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B、丹酚酸A、丹酚酸C、隐丹参酮、丹参酮Ⅰ、丹参酮ⅡA的含量。结果见表3。

2.6.1  醇提液中各成分含量比较

同一浓度醇提液中，丹酚酸B含量最高，原儿茶醛和阿魏酸含量最低。总体来看，水溶性成分含量高于脂溶性成分。不同浓度醇提液中各成分含量测定结果比较可以看出，丹参素钠、咖啡酸和丹酚酸C溶出量随溶剂极性的降低而降低;迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B、丹酚酸A含量均随溶剂极性的降低呈现先升高后降低的趋势，但紫草酸、迷迭香酸、丹酚酸A提取峰值分别出现在20%、40%和60%乙醇附近，醇浓度为20%～80%对丹酚酸B的溶出量没有明显影响;隐丹参酮、丹参酮Ⅰ、丹参酮ⅡA溶出量随溶剂极性降低而升高，醇浓度为80%与95%没有明显差异。结果见图2。

2.6.2  不同浓度醇提液总水溶性成分、总脂溶性成分含量比较

丹参不同浓度醇提液中，随溶剂极性降低，水溶性成分总量呈先升高后降低的趋势，乙醇浓度为40%时水溶性成分总量最高，乙醇浓度为95%时水溶性成分溶出总量明显减少;脂溶性成分总量一直处于增加状态，乙醇浓度为80%与95%没有明显差异。见图3。

3  讨論

本研究以12种化合物的含量作为考察指标，采用单因素法分别考察了不同提取方式（加热回流法和超声法）、不同提取溶剂体积（6、10、20、40倍）、不同提取次数（1、2、3次）和不同提取时间（45、60、90 min），最终确定丹参样品的最佳提取方法为用40倍溶剂超声提取1次，每次60 min，此条件下目标成分提取较为完全，提取效率高、重复性较好。

考虑到待测成分复杂，化学属性相差较大，为确保在同一检测条件下对所有12种成分都有较好的分离效果，本研究对不同种类、不同厂家的色谱柱进行考察，同时对流动相、柱温和流速进行优化，最终确定采用Agilent Extend-C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流动相为乙腈-0.1%磷酸水溶液，梯度洗脱，柱温25 ℃，在该条件下所得色谱图的分离效果、峰形等均较好。

本试验以不同浓度乙醇为代表，探讨溶剂极性对丹参化学成分溶出量的影响，结果表明，溶剂极性对丹参各成分溶出有很大影响。整体而言，水溶性成分随溶剂极性的降低而降低，脂溶性成分随溶剂极性的降低而升高。乙醇浓度在40%左右对水溶性成分的提取较充分，80%～95%对脂溶性成分的提取更充分;醇浓度为60%～80%对水溶性和脂溶性成分的提取均比较充分。如需提取水溶性成分，可以重点考察乙醇浓度在40%左右时的工艺;如提取脂溶性成分，因乙醇浓度80%～95%时提取差异不大，考虑到经济效益、溶剂循环利用，可以重点研究醇浓度为80%左右的工艺;而乙醇浓度在60%～80%可同时兼顾水溶性成分和脂溶性成分。同理，需要某一种或几种成分时，可参照此结果缩小研究范围，筛选最优工艺。

多成分、多靶点的整体作用是中药发挥疗效的基础。在优选中药提取工艺的过程中，若只以某一成分的含量为指标，则不能反映全方的整体效应。此前对中药提取工艺的研究常以单一成分或少数成分含量为指标对提取工艺进行优选，存在一定的局限性。《中华人民共和国药典》分别以丹酚酸B和丹参酮ⅡA为指标成分对丹参中水溶性和脂溶性成分进行含量测定^[1]，导致以往研究常以丹酚酸B或丹参酮ⅡA含量为指标来优选丹参提取工艺，但丹参中水溶性成分和脂溶性成分众多，其他成分也有较好的药理作用，单一指标成分的含量不能全面衡量丹参提取工艺的优劣，所以应对多成分进行控制，从而保证丹参提取物的质量和疗效。

本研究建立的分析方法可同时测定丹参中9种水溶性成分和3种脂溶性成分，保留时间稳定、分离效果好，方法精密度高，测定结果准确，可为丹参药材和制剂工艺的控制方法提供依据;从不同浓度乙醇对丹参化学成分溶出量角度进行比较分析，可为丹参制剂工艺研究提供参考。

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