STAT3及其靶基因STAT3在声门上喉癌手术切缘组织中蛋白的表达及与预后的关系

张红蕾 李佳 李大鹏 王荣丽 郭睿

(1. 中国人民解放军空军特色医学中心耳鼻咽喉头颈外科 北京 100142；2.河北省保定市第二医院耳鼻咽喉头颈外科 保定 071051；3.安徽省亳州市人民医院耳鼻咽喉头颈外科 亳州 236800)

喉癌手术切缘的传统研究方法主要是临床和病理观察，随着免疫组化技术及分子生物学的发展，近年来已达到了细胞和分子水平。细胞周期素D1是重要的细胞周期素蛋白，作为细胞周期的正向调控因素，其异常表达是导致细胞周期调控机制受到破坏的主要原因之一，与恶性肿瘤的发生、发展密切相关[1]。有研究[2]表明，细胞周期素D1在正常组织中表达量很少甚至不表达，而在包括头颈部鳞状细胞癌在内的人体许多恶性肿瘤中存在该蛋白质的过度表达。信号转导子和转录激活因子家族(STATs)于20世纪90年代被发现，STAT3是其重要成员[3]；但是，STAT3的表达与喉癌患者手术切缘、术后复发情况以及临床病理情况的关系却鲜有报道。本文应用免疫组化技术检测声门上喉癌手术切除标本中不同切缘部位喉癌组织的STAT3蛋白表达情况，并对上述问题进行探讨。

1 材料与方法

1.1 材料 2008～2017年收治的手术切缘常规病理学检查未发现癌细胞的声门上喉鳞状细胞癌(laryngeal squamous cell carcinoma, LSCC)患者82例，其中男性55例、女性27例；年龄39～73岁，中位年龄58.2岁。病例纳入标准：符合2002年国际抗癌联盟(UICC)修订标准；病例排除标准：术前接受放疗、化疗等的患者。其中高分化19例、中分化37例、低分化26例；TNM分期：T1期13例、T2期23例、T3期28例、T4期18例。标本取得后立即测量肉眼下距肿瘤最短的切缘距离，将其按2、5、10、25 mm分为4组。将所有标本水平连续切成5 mm厚的组织片，将最短切缘组织片从切缘向肿瘤边缘纵向再次连续切片制成4～5 μm厚的薄组织片用于免疫组化检测。对照组75例正常喉组织取自同期全喉切除标本的远端组织，距肿瘤边缘超过3 cm，病理检查确认为正常喉黏膜上皮，同样制成4～5 μm厚的组织片。所有患者术后随访3年。本研究通过我院伦理委员会批准通过。

1.2 试剂来源 STAT3兔单克隆抗体购自美国Cell Signaling Technology(CST)，SP试剂盒购自北京中杉生物技术公司，二氨基联苯胺(diaminobenzidine,DAB)试剂盒购自福州迈新生物技术公司。

1.3 方法 采用免疫组化染色SP法。切片脱蜡水化，微波热修复，过氧化物酶阻断剂灭活过氧化物酶活性，滴加正常羊血清封闭液，滴加一抗(STAT3兔单克隆抗体)后于4 ℃过夜；滴加生物素标记的二抗37 ℃ 1 h，滴加链霉亲和素-过氧化物酶溶液；DAB法显色5～10 min，在显微镜下掌握染色程度，苏木素复染2 min。用已知阳性组织切片作阳性对照[4]，用磷酸盐缓冲液(PBS)作阴性对照。

STAT3阳性细胞为细胞质、细胞核内出现棕黄色颗粒，高倍镜下任取5个视野进行计数，每个视野计数200个细胞。着色细胞<5%为阴性(-)，5%～29%为弱阳性(+)，30%～49%为中度阳性(++)，≥50%为强阳性(+++)[5]。

所有喉癌患者术后定期复诊随访，行纤维喉镜检查，了解喉内情况有无局部复发和转移，观察切缘STAT3表达水平与喉癌术后局部切缘复发的关系。由于本研究重点在病理学方面，因此随访过程中没有对患者进行增强CT或者增强MRI检查。

1.4 统计学处理 应用SPSS 19.0软件进行统计学处理。切缘STAT3阳性表达患者不同切缘长度组间复发率、切缘STAT3在不同病理资料组间阳性表达率的比较均用χ2检验，切缘STAT3表达阴性和阳性2组间生存分析采用对数秩(Log-rank)检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 STAT3阳性表达患者不同切缘距离与复发的关系 82例喉癌组织中STAT3阳性表达68例，阳性率为83%。该68例癌组织STAT3阳性表达者中，24例切缘检测到STAT3阳性表达。该24例患者中，17例发生局部复发，STAT3切缘阳性患者复发率为70.8%(17/24)， STAT3切缘阴性表达者7例复发，复发率为15.9%(7/44)，2组差异有统计学意义(χ2=8.315，P<0.05)。2组STAT3表达比较：复发组STAT3表达强阳性(+++)、中度阳性(++)的构成比例明显高于未复发组，差异有统计学意义(Z=8.216，P<0.05)。

通过对以上数据进行Fisher精确概率法两两组间比较，结果显示，切缘(5 mm处和切缘10 mm处)STAT3的阳性表达率差异有统计学意义(χ2=2.380，P<0.05)，切缘2 mm处STAT3的阳性表达率差异无统计学意义(χ2=3.748，P>0.05)，切缘10 mm处与25 mm处STAT3的阳性表达率差异没有统计学意义(χ2=5.524，P>0.05；表1)。

表1 STAT3 蛋白在喉癌组织和癌旁不同距离组织中的表达

结果提示，以切缘 STAT3 阳性表达与否作为辅助评判标准，安全切缘位于距肿瘤边缘5 mm处。

2.2 切缘 STAT3阳性与阴性表达患者的生存分析 术后随访3年，48例STAT3阳性表达患者中失访5例，包括切缘阳性患者2例、切缘阴性患者3例。随访资料完整的15例切缘阳性患者死亡11例，28例切缘阴性患者死亡4例，Kaplan-Meiel生存曲线见图1。Log-rank检验切缘阴性组生存率高于阳性组(Log-rank=6.657，P<0.05)。

2.3 切缘STAT3表达与临床病理参数的关系 详见表2。

图1. Kaplan-Meiel生存曲线

表2 切缘 STAT3阳性表达与临床病理参数的关系(n)

喉癌切缘STAT3阳性表达率在颈淋巴结转移组显著高于无淋巴结转移组，2组比较差异有统计学意义(χ2=5.741，P<0.05)。喉癌切缘STAT3阳性表达率在临床分期T3及T4组显著高于T1及T2组，组间比较差异有统计学意义(χ2=6.612，P<0.05)，但在T3、T4组与T1、T2组比较差异无统计学意义(P>0.05)。喉癌切缘STAT3阳性表达率在组织病理高、中、低分化3组间两两比较的差异均无统计学意义(P值均>0.05)。

3 讨论

喉癌是耳鼻喉科常见的恶性肿瘤，近年来发病率有逐渐增多趋势，由于其所处部位为呼吸及发声的重要器官，所以对患者危害性极大，手术是目前治疗喉癌的主要措施[6]。手术治疗一方面需要尽可能地完整切除肿瘤，另一方面也需尽量保留喉功能。因此，原发病灶的切除范围即喉癌手术安全切缘问题得到临床医师的重视。目前判断手术切缘组织是否有肿瘤组织残留的常规方法是冷冻或石蜡切片病理诊断，根据切片中癌细胞残留与否判断其是否为安全切缘[7-9]。导致切缘病理假阴性的原因：一方面目前组织病理诊断技术尚不能检测出少量甚至微量的残留肿瘤细胞，即微转移灶[10]；另一方面可能存在已出现了分子水平改变的癌前病变细胞，进而导致肿瘤复发。目前已有很多学者应用免疫组化的方法检测病理阴性切缘组织的某些蛋白分子的异常表达，并对手术安全切缘进一步定性判断，已证明P53、ras、c-myc、MMP-2、c-FLIP、RECK、Survivin等多种蛋白在喉癌组织、近癌组织、远癌组织中的表达差异具有统计学意义[11-13]。

细胞周期素作为细胞周期重要的正性调节因子在肿瘤的发生、发展中所扮演的角色日益成为关注的焦点，其中STAT3是已被证实与肿瘤有最直接关系的癌基因，其作用机制与Rb蛋白产物(pRb)密切相关。STAT3/CDK4复合物中细胞周期素D1能与pRb结合使其磷酸化，pRb被磷酸化后释放出转录因子E2F，后者通过激活基因转录，促使细胞进入S期。而细胞周期素D1与喉癌的密切关系也已得到很多学者的证实[14]。炎性肝细胞腺瘤(inflammatory hepatocellular adenma，IHCA)是一种良性肝脏肿瘤，以炎性浸润和急性期严重反应过表达为特点。Pilati等的报道显示，60%的IHCA是通过IL-6家族的细胞因子共受体gp130的体细胞框内缺失而激活STAT3。在第46届欧洲肝脏研究学会(EASL)年会上，Pilati报告了在其余IHCA患者中探索新的STAT3激活机制的研究，结果显示人类肿瘤中具有体细胞STAT3突变，人类肿瘤中STAT3激活的这种新机制，可以被Src抑制剂阻断。同时，研究结果强调了Src-STAT3通路作为良性肝肿瘤发生中关键事件的作用。研究者对114例腺瘤的STAT3编码区进行测序，对所有识别出的基因突变通过定点诱变进行复制，其功能性影响通过定量RT-PCR和STAT3-报告基因，在肝癌细胞株Hep3B、HepG2或HuH7中进行分析。STAT3磷酸化水平和细胞定位分别通过免疫印迹和免疫荧光分析。为明确STAT3突变激活的机制，研究者进行免疫沉淀分析，并使用RNA干扰和药理学药物靶定STAT3的伙伴基因。结果显示，12%的非突变gp130 IHCA中可见杂合型体细胞STAT3突变，而在其他HCA亚型中未发现此突变。这些突变多数导致SH2区域的氨基酸替代，该区域对STAT3的二聚作用很重要。不同于野生型STAT3，所有STAT3突变体可以在无配体情况下激活所有细胞系中的白细胞介素-6(IL-6)信号传导。而且研究者发现，突变STAT3的组成性激活需要酪氨酸705的磷酸化和STAT3突变集中在细胞核。此外，在无配体刺激下，STAT3突变体可以形成同源二聚体，其对IL-6暴露高度敏感。使用2种不同的Src抑制剂，可见基线STAT3突变活性有赖于Src酪氨酸激酶。相反，JAK抑制剂和SiRNA分析显示，在STAT3突变的组成性激活中并不需要gp130和JAK激酶。

STAT3是一种信号转导子和转录激活子，它通过外界可以直接对相应靶基因进行激活转录。本实验检测声门上喉癌患者癌旁组织不同距离STAT3蛋白水平的表达，结果显示STAT3 蛋白的阳性表达率为 93%，相对于正常组织12%的阳性率，组间差异有统计学意义(P<0.05)。喉癌组织的STAT3阳性率明显高于正常组织，并且由内向外递减[15-16]。相关研究表明，STAT3可以通过编码凋亡抑制剂以及细胞周期调节剂等上调其基因表达，对肿瘤发生、发展进行干预，很有可能对声门上喉癌的肿瘤组织诊断、治疗提供病理学的靶向指标。采用免疫组化染色SP法，通过对声门上喉癌的癌组织及癌旁不同距离组织中STAT3 的表达情况进行分析，可以了解到正常喉癌组织中的STAT3显著表达于喉癌组织和对应的癌旁>20 mm处正常组织[17]。我们应用免疫组化技术检测喉癌不同切缘长度STAT3表达情况及其与复发率的关系，进而从分子水平分析喉癌手术切除界限。

本研究所选82例喉癌样本中有68例癌组织STAT3阳性表达，其手术切缘常规病理学检查均未发现癌细胞即病理切缘阴性，但仍有24例患者复发，切缘STAT3阳性表达组与切缘STAT3阴性表达组间复发率比较差异有统计学意义，提示STAT3可作为补充病理切缘诊断的分子预警标志。进一步分析，在切缘STAT3阳性表达的患者中，切缘25 mm与10 mm组间复发率比较的差异有统计学意义，而切缘2 mm与5 mm组间以及切缘10 mm与25 mm组间复发率比较的差异没有统计学意义，提示安全切缘位于5 mm处为宜。这与目前被广泛接受的安全切缘距离相一致[18]。很多学者对喉癌术后患者进行生存分析，结果均提示手术切缘情况与其预后密切相关。病理切缘阴性和阳性患者的生存率和复发率明显不同，阳性患者预后差。

尽管本研究所选病例全部为病理切缘阴性标本，但STAT3的表达情况不同，STAT3阳性表达组和阴性表达组的生存率差异仍具统计学意义(Log-rank=5.83，P<0.05)，说明STAT3可作为喉癌术后预后判断的重要指标[19]。我们将喉癌患者手术切缘中STAT3的表达情况与临床病理资料综合分析发现，喉癌切缘中STAT3的阳性表达显著集中在T3、T4期和颈淋巴结转移病例，说明肿瘤浸润范围较广以及有颈淋巴结转移者，STAT3阳性切缘发生率增高，这与目前部分学者研究的病理切缘阳性与肿瘤分期及颈淋巴结转移情况的关系相一致，但STAT3作为分子标志更加敏感。本研究结果并未发现STAT3的表达与组织分化程度存在明显相关[20-21]。

当然，鉴于本研究样本量有限，部分结果尚需进一步扩大样本量并反复验证以保证结果的有效临床参考意义。虽然喉癌手术方法在不断改进，但晚期喉癌5年生存率未见明显改善，将STAT3等分子标志物应用于喉癌的诊断及治疗中，有利于更好地评估手术安全切缘及预测肿瘤侵袭、转移能力，亦为临床提供更多可能的靶向治疗途径。