赶黄草挥发油GC-MS分析及保肝靶点筛选

杨 欣，李亚辉，刘 明，吕润霖，钱海兵

贵州中医药大学基础医学院，贵阳 550025

中药赶黄草最早载于《救荒本草》，为苗族民间治疗肝病的常用药，主要分布在四川、贵州、湖南等地，具有清热解毒、退黄化湿，活血散瘀，利水消肿之功效，以全草入药[1]。目前，已有多项研究表明，赶黄草的多种活性成分具有保肝作用，对肝脏功能有调节作用，特别是对酒精性脂肪肝、肝纤维化和肝硬化有显著治疗作用[2]。中药材在保肝上凸显重要优势[3]，但是中药材化学成分多，需要通过大量工作筛选保肝的活性成分及靶点。随着科学技术的不断发现，网络药理学和分子对接技术的出现，多学科的相互交叉，给中医药的发展增添新思想和新技术，同时减少了实验工作量和实验成本[4]。赶黄草具有保肝的作用，但是其挥发油的药理作用的机制尚未研究全面。本研究基于分析化学结合计算机辅助药物设计探讨赶黄草挥发油在保肝上的应用，为赶黄草产品开发提供理论依据。

分子对接(molecular docking)可以解释活性成分与靶标的作用机制，从空间结构上揭示化合物结构-活性关系(structure-aactivity relationship，SAR)[5]，最终目标筛选出关键活性成分及靶点，为药理、细胞和动物实验提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

材料：赶黄草(PenthorumchinensePursh)采自四川泸州古蔺，经贵阳中医学院药学院魏升华教授奠定为扯根菜属PenthorumGronov.ex L.植物扯根菜PenthorumchinensePursh的干燥地上部分，密封室温放置样本室，编号为201812005，备用。

试剂：正己烷(南京复优化工贸易有限公司，色谱纯)；无水硫酸钠(上海弘顺生物科技有限公司)。

仪器：电热套(KDM-2000，江苏杰瑞尔电器有限公司)；气质联用仪(Agilent 6890/5975C，美国Agilent公司)；电子天平 (UX2200H，日本岛津公司)；挥发油提取器(厦门海标科技有限公司)；LK-400A摇摆式中药粉碎机(LK-400A，上海隆拓仪器设备有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 赶黄草挥发油的提取及样本处理

赶黄草(四川泸州)挥发油基于水蒸气蒸馏法(steam distillation，SD)提取，取干燥的赶黄草100 g，粉碎，置于2 L 圆底烧瓶中，混合均匀，连续提取5 h，得到具有芳香气味的透明油状液体 1.8 mL，经无水 Na2SO4干燥，备用[6]。

1.2.2 赶黄草挥发油成分的GC-MS 分析

取一定量的挥发油样品，采用HP6890/5975C GC/MS联用仪(美国安捷伦公司)进行GC-MS分析。

色谱柱为FB-5MSI(30 m×0.25 mm×0.25 μm) 弹性石英毛细管柱，初始温度48 ℃(保留2 min)，以4 ℃/min升温至220 ℃，再以15 ℃/min升温至310 ℃，保留5 min，运行时间：56 min；汽化室温度250 ℃；载气为高纯He(99.999%)；柱前压7.65 psi，载气流量1.0 mL/min，分流，分流比20∶1，溶剂延迟时间：5.0 min。

离子源为EI源；离子源温度230 ℃；四极杆温度150 ℃；电子能量70 eV；发射电流34.6 μA；倍增器电压1 659 V；接口温度280 ℃；质量范围29～450 amu。组分质谱数据采用NIST库进行定性分析，峰面积归一法进行定量分析。

1.2.3 靶标蛋白筛选

赶黄草挥发油9个主要活性成分：香叶基丙酮，金合欢基丙酮，叶绿醇，二十三烷，二十四烷，二十五烷，二十六烷，二十七烷，2-硬脂酸单甘油酯靶点筛选基于SwissADME(http://www.swissadme)在线分析，每个活性成分预测出15个关键靶标蛋白[7,8]，包括蛋白名称、基因名称、基因ID等等。

1.2.4 生物功能分析

靶点GO功能分析基于DAVID 6.8(DAVID 6.8，https://david.ncifcrf.gov/)在线分析，将70个靶点导入DAVID数据库，点击限定物种为人源，设定阈值P<0.01，GO(Gene Ontology)注释分析包含，即生物过程 (biological process，BP)、细胞组分 (cellular component，CC)以及分子功能 (molecular function，MF)。

1.2.5 Hub靶点筛选

基于Cytoscape3.5.1中的Cytohubba模块[9，10]，依据度(degree)，边过滤成分(edge percolated component，EPC)，最大邻居组件(maximum neighborhood component，MNC)，最大团中心性(maximal clique centrality，MCC)四种算法输出hub基因。

1.2.6 疾病分析

将筛选出的hub基因进行疾病分析，基于CTD(comparative toxicogenomics database)在线分析，以“CNR2，CNR1，CCR5，CCR3，PRKCA，PRKCB”为关键词分别检索相关疾病，选择已经有实验验证的 “T”的疾病进行分析。

1.2.7 分子对接验证分析及关键氨基酸位点

CNR1从蛋白质晶体结构数据库RCSB(http://www.rcsb.org/pdb) 获取 3D 晶体结构，PDBID：5U09，晶体结构在2.6Å的解象下以X衍射的方法获得。采用Surflex-Dock 模块完成分子对接(标准模式)[11]，其他参数均采用 Sybyl默认值，以 Total-Score 大于6为阈值，挑选对接效果好的化合物[12]。基于Ligplot 1.4.5软件进行相互作用分析，结果以氢键、疏水作用输出，筛选关键的氨基酸位点。

1.2.8 关键化学成分的ADME/T性质

基于SwissADME(http://www.swissadme.ch/)进行初期药物开发毒性筛选。相关参数包括： CYP450酶的抑制性(cyp inhibitory promiscuity)、氢键供体数(h-bond donors,HBD)、氢键受体数(h-bond acceptors,HBA)、可旋转键数(rotatable bonds，RBN)、分子量(molecular weight，MW)、脂水分配系数(mlogp)等。

2 实验结果

2.1 挥发油化学成分

从GC-MS 分析结果(表1)可知，赶黄草挥发油共检测出31种活性成分，占总峰面积的69.539%，主要化学成分有为香叶基丙酮(2.672%)，金合欢基丙酮(31.907%)，叶绿醇(2.392%)，二十三烷(4.01%)，二十四烷(5.487%)，二十五烷(5.04%)，二十六烷(3.552%)，二十七烷(2.621%)，2-硬脂酸单甘油酯(3.26%)，占总峰面积的62.733%，主要化学成分mol2结构基于TCSMP(中药系统药理学数据库和分析平台)进行下载[13,14]，图1为赶黄草挥发油主要活性成分(相对含量>2%)离子流图。

图1 挥发油主成分总离子流色谱图Fig.1 TIC chromatogram of main components of volatile oil注：10.香叶基丙酮；15.金合欢基丙酮；19.叶绿醇；21.二十三烷；22.二十四烷；23.二十五烷；24.二十六烷；25.二十七烷；26.2-硬脂酸单甘油酯。Note:10.Geranylacetone;15.Farnesylacetone;19.Phytol;21.Tricosane;22.Tetracosane;23.Pentacosane;24.Hexacosane;25.Heptacosane;26.2-Monostearin.

表1 挥发油化学成分

续表1(Continued Tab.1)

编号No.保留时间tR(min)化合物Compound分子式Molecular formula分子量Molecular weight相对含量Relative percent (%)2349.31二十五烷 PentacosaneC25H523525.042450.01二十六烷 HexacosaneC26H543663.5522550.65二十七烷 HeptacosaneC27H563802.6212650.822-硬脂酸单甘油酯 2-MonostearinC21H42O43583.262751.23二十八烷 OctacosaneC28H583941.2092851.45角鲨烯 SqualeneC30H504100.6072951.82二十九烷 NonacosaneC29H604081.7683052.46三十烷 TriacontaneC30H624220.5223153.18三十一烷HentriacontaneC31H644370.36Total69.539

2.2 GO功能注释分析

香叶基丙酮，金合欢基丙酮，叶绿醇，二十三烷，二十四烷，二十五烷，二十六烷，二十七烷，2-硬脂酸单甘油酯9个关键活性成分共筛选出135个靶标蛋白，去掉重复靶标蛋白，共有70个靶标蛋白，基于DAVID对70个潜在靶点的GO功能注释分析[15]，如表2、图2所示，在生物过程中，70个靶点基因主要参与肽-酪氨酸脱磷酸化(peptidyl-tyrosine dephosphorylation)、血小板激活(platelet activation)等生物过程；主要分布在质膜(plasma membrane)、内质网(endoplasmic reticulum)等；分子功能上，靶点基因主要有蛋白质激酶c活性(protein kinase C activity)、蛋白质酪氨酸磷酸酶活性(protein tyrosine phosphatase activity)、蛋白质激酶结合(protein kinase binding)等功能。

表2 潜在靶点的GO功能注释分析

续表2(Continued Tab.2)

GO注释GO annotation 编号No.名称Name百分比Percentage (%)P-value7Growth cone7.28.77E-048Integral component of membrane46.40.00139Perinuclear region of cytoplasm130.0019分子功能10Mitochondrial membrane5.80.005Molecular function1Glucuronosyltransferase activity131.82E-132Protein kinase c activity10.11.66E-113Transferase activity, transferring hexosyl groups8.71.20E-074Protein tyrosine phosphatase activity11.61.49E-075C-c chemokine receptor activity5.81.34E-056Protein tyrosine/serine/threonine phosphatase activity7.21.44E-057Protein kinase binding14.51.89E-058Chemokine receptor activity5.84.08E-059Calcium-independent protein kinase c activity4.34.78E-0510Calcium-dependent protein kinase c activity4.39.54E-05

图2 潜在靶点的GO生物学过程富集分析Fig.2 GO biological process enrichment analysis of potential targets

2.3 Hub靶点分析

70个共有差异表达基因通过STRING进行相互作用分析，通过 Cytoscape3.5.1中的cytoHubba中的 epc，degree，mcc，mnc四种算法输出前10个hub基因(表3)，通过取交集的方法获取共有6个hub靶点(CNR2，CNR1，CCR5，CCR3，PRKCA，PRKCB)。

2.4 化学成分-靶点-疾病分析

Hub靶点通过CTD筛选参与的关键疾病，通过化学成分-靶点-疾病分析(表4)，我们发现赶黄草挥发油活性成分2-硬脂酸单甘油酯、香叶基丙酮、金合欢基丙酮在肝硬化、肝炎和非酒精性脂肪肝疾病中发挥重要作用。

表3 Hub基因筛选

2.5 关键活性成分分子对接分析及相互作用分析

大麻素受体1(cannabinoid receptor 1，CNR1)为香叶基丙酮，2-硬脂酸单甘油酯，金合欢基丙酮共有靶标蛋白，采用分子对接进行验证，CNR1具有3个原配体(SO4，PEG，7DY)，利用Docking 模块分别以SO4，PEG，7DY作为模板形成结合口袋，对接结果以-log10 为单位模拟结合能力，配体与受体结合稳定性以Total Score 值的大小来评价，Total Score越大越稳定。结果发现3个活性成分与PEG，7DY原配体为模板形成结合口袋具有较好的结合，三个活性成分的Total score(TS)>6。

香叶基丙酮，2-硬脂酸单甘油酯，金合欢基丙酮与CNR1(PEG)相互作用有很大的相似性，结构比对显示Val228，Phe237，Ala236等氨基酸残基相对位置相同，氨基酸类型相同(表5)。香叶基丙酮，2-硬脂酸单甘油酯，金合欢基丙酮与CNR1(7DY)相互作用有很大的相似性，结构比对显示Val196，Cys386，Ile105等氨基酸残基相对位置相同，氨基酸类型相同(表6)。我们可以推测这些残基就是我们要寻找的CNR1重要残基。

2.6 关键化学成分的理化性质

将2-硬脂酸单甘油酯、香叶基丙酮、金合欢基丙酮进行ADMET性质分析。CYP450酶的抑制性：低抑制(low)和高抑制(hight)；根据Lipinski规则，小分子应该具备氢键供体数≤5，氢键受体数≤10，可旋转键数≤10，-2.5≤ Log Po/w(mlogp)≤4.15，MW≤500 g/mol，如果过多参数不符合，会影响药物的溶解性及肠吸收能力，2-硬脂酸单甘油酯、香叶基丙酮、金合欢基丙酮基本遵循Lipinski规则(表7)。

表5 关键活性成分与大麻素受体1(PEG)相互作用分析

表6 关键活性成分与大麻素受体1(7DY)相互作用分析

表7 关键化学成分理化性质

3 结论

本研究基于网络药理学及分子对接技术揭示了赶黄草挥发油化合物结构-活性关系，鉴定出31个活性成分，关键活性成分共筛选出70个靶标蛋白。6个hub靶点(CNR2，CNR1，CCR5，CCR3，PRKCA，PRKCB)，3个主要保肝活性成分：香叶基丙酮，2-硬脂酸单甘油酯，金合欢基丙酮。研究结果初步筛选出赶黄草挥发油保肝的关键靶点及活性成分，为赶黄草挥发油保肝机理解释提供理论依据。

本次研究中发现赶黄草挥发油可能通过调节大麻素受体2(cannabinoid receptor 2,CNR2)，大麻素受体1(cannabinoid receptor 1,CNR1)，C-C趋化因子受体5(C-C chemokine receptor type 5，CCR5)，C-C趋化因子受体3(C-C chemokine receptor type 3,CCR3)，蛋白激酶Cα(protein kinase Cα，PRKCA)，蛋白激酶Cβ(protein kinase Cβ，PRKCB)防治肝硬化、肝炎和非酒精性脂肪肝等肝脏疾病。大麻具有重要的药用价值，其活性化合物为大麻素，人体体内存在两种大麻素受体[16,17]。大麻素系统紊乱可导致机体代谢、免疫系统、心血管系统、神经系统、消化系统等疾病。CNR1是脂质类内源性大麻素信号系统的主要受体，在脑发育、脂肪代谢平衡和神经系统功能障碍等机制中发挥着重要作用[18,19]。通过相互作用验证分析发现香叶基丙酮、2-硬脂酸单甘油酯、金合欢基丙酮与CNR1作用的氨基酸位点有较大的相似性，这些关键的氨基酸位点可能与赶黄草挥发油的药效作用密切相关。

本研究建立了快速筛选挥发油活性成分药理作用的方法，能够快速筛选出药理作用的关键靶点及活性成分，打破了传统的挥发油抗氧化、抗菌等方面的体外研究，为挥发油药理作用的评价提供新的思路，为其挥发油产品开发提供理论指导。因此，基于分子对接技术揭示化合物结构-活性关系，更具准确性和针对性，可以加快物质基础研究效率，同时能有效阐明有效成分-作用靶点的相关性，为其中药多成分、多效应的科学本质提供新的研究思路。