玉米种子纯度SSR分子标记检测研究报告

李世聪 朱华国 薛飞

摘   要：本试验利用SSR分子标记法，对玉米杂交种金庆707和世宾338玉米杂交种的种子纯度进行了检测。结果表明：8对SSR引物bnlg1940k7、 phi053k2、bnlg2291k4、umc1705w1、bnlg2305k4、bnlg1702k1、phi080k15和umc1492y13可用于金庆707种子纯度鉴定;8对SSR引物umc2105k3、bnlg2291k4、umc1705w1、bnlg161k8、bnlg1702k1、umc1545y2、phi080k15和umc1432y6可用于品种世宾338种子纯度鉴定。选用引物phi053k2检测金庆707的种子纯度为92%，选用引物bnlg1702k1检测世宾338的种子纯度为66%，两者均未达到国家标准。本研究从玉米20对SSR核心引物中筛选出8对多态性引物可用于金庆707和世宾338两个品种的种子纯度检测，大大缩短了种子纯度检测的周期。

关键词：SSR分子标记;玉米杂交种;种子纯度

玉米是我国一种很重要的粮食作物，也是饲料加工的重要来源，在我国农业生产中处于很重要的位置[1]。种子是农业生产中最根本的生产资料，种子质量的好坏决定了农作物产量的多少和品质的优良，而种子纯度的高低又是显示种子质量好坏的一项重要因素[2]。种子纯度的检测是发挥作物产量潜能和保证作物质量的必要措施。根据前人的研究，种子纯度下降1个百分点，将会直接导致作物产量减少大约1%[3]。种子市场的不规范，对育种者、种植户以及经销商的利益造成极大的损害。新疆是中國的农业大省，种子市场的“多乱混杂”，严重危害到育种者、种植户以及经销商的利益，所以种子纯度的鉴定十分必要。种子纯度鉴定的方法主要包括田间形态鉴定和生化标记鉴定及DNA分子标记鉴定等[4]。

最初的田间形态鉴定，存在鉴定周期长、结果受环境影响较大、准确性差等缺点[5];生化标记鉴定是利用不同品种蛋白质的不同得以鉴定，蛋白质电泳鉴定容易遭受环境和生长状况的影响。陈皆辉[6]、张承毅[7]等人利用生化标记鉴定的方法快速准确地将不同品种分开。相比之下，SSR标记具有多态性高、呈共显性、操作简便等优点[8]。SSR分子标记法已广泛应用于各种农作物的真实性以及纯度鉴定，李苗[9]、

刘宏魁[10]、李阳[11]等人利用多态性SSR引物对玉米种子纯度和指纹图谱进行了分析。吴明生[12]等人利用SSR标记检测了辣椒的种子纯度。对玉米种子纯度进行检测，利于玉米种子市场的监管、保障生产者和经营者的利益。

本研究从玉米20对SSR引物中筛选出可用于金庆707和世宾338两个玉米品种纯度鉴定的特异性引物，并利用特异性引物对金庆707和世宾338抽样种子进行纯度鉴定。

1   材料与方法

1.1   材料

试验材料：金庆707杂交种及其父母本种子、世宾338及其父母本种子，20对SSR引物序列来自数据库（https：//www.maizegdb.org/）。

试剂：氯仿、SDS提取液、异丙醇、5mol/L氯化钠溶液、β-巯基乙醇、70%乙醇、TE缓冲液、ddH2O、10×Buffer、MgCl2、dNTP、Taq酶、引物、95%乙醇。

1.2   试验方法

1.2.1   SDS法提取玉米种子的DNA

参考郭景伦等[13]的方法，提取玉米DNA，每个品种随机选取50粒种子提取种子胚中的DNA。

1.2.2   SSR引物筛选及纯度鉴定

选取玉米品种鉴定技术规程NY/T 2475-2013中公布的20对玉米SSR引物，由北京六合华大基因科技股份有限公司合成。以金庆707和世宾338父母本基因组DNA为模板，经过PCR扩增和8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，在20对SSR引物中筛选出能够明显区分父母本的多态性引物。

PCR反应体系：10×PCR Buffer 2μL，2.5mM dNTPs1.2μL，上下游引物10μM各0.25μL，5U/μLTaq DNA聚合酶0.2μL，模板DNA2μL，无菌水补全到20μL。SSR的扩增程序为：94℃预变性4min，94℃变性45s，引物退火温度退火45s，72℃延伸45s，共35个循环;72℃延伸10min，PCR产物保存于4℃。反应程序的反应时间、温度、次数等可根据PCR仪器、酶以及引物等的不同作出相应的调节。

扩增产物通过8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（150V60～80min）分离，银染显色，观察记录。

1.2.3   数据记录

检测样品与对照样品（父本、母本）在同一电泳板上并排电泳时，将检测样品与对照样品两两比较，并标记每个位点的异同情况。

2   结果与分析

2.1   用于金庆707和世宾338纯度鉴定的多态性SSR引物筛选

20对SSR引物对金庆707和世宾338父母本DNA进行扩增，结果分别见图1、图2。在金庆707亲本间扩增产物具有明显差异的引物有bnlg1940k7、phi053k2、bnlg2291k4、umc1705w1、bnlg2305k4、bnlg1702k1、phi080k15、umc1492y13共8对SSR引物，在世宾338亲本间扩增产物具有明显差异的引物有umc2105k3、bnlg2291k4、umc1705w1、bnlg161k8、bnlg1702k1、umc1545y2、phi080k15、umc1432y6共8对SSR引物。

2.2   金庆707种子纯度鉴定

从筛选出的8对可用于金庆707种子纯度鉴定的引物中选用引物phi053k2对金庆707及其父母本基因进行扩增，通过对电泳条带的分析可以得出金庆707种子样本的纯度。结果如图3所示，所抽种子检测样品样本有3种类型：杂交种金庆707种子、父本自交系种子和母本自交系种子。根据公式计算，本批金庆707种子纯度为92%，其中有4%的父本自交系杂种，4%的母本自交系杂种。

2.3   世宾338种子纯度鉴定

选用引物bnlg1702k1对世宾338及其父母本DNA进行扩增，对抽样批次世宾338种子样本的种子纯度进行检测，结果如图4所示，所抽种子检测样品样本有2种类型：杂交种种子和母本自交系种子。经过计算，本批世宾338的种子纯度为66%，含有34%的母本自交系杂种。

3   讨论

本研究从20对玉米SSR引物中筛选出多态性引物，对金庆707和世宾3382个品种的种子纯度进行了检验。刘勤红[14]、卢虹[15]、李汝玉等[16]采用了SSR分子标记的方法，分别在棉花、油菜和玉米等作物的种子纯度上进行研究，并且得到的结果与传统田间鉴定相符合。结合前人大量试验和本试验的结果表明，SSR分子标记法在玉米和其他作物的种子纯度鉴定中都能够取得良好的结果。

4   结论

本试验利用SSR分子标记法对2个玉米杂交种金庆707和世宾338进行了种子纯度鉴定。金庆707玉米杂交种抽样批次的种子纯度为92%， 世宾338玉米杂交种抽样批次的种子纯度为66%，都未达到玉米单交种大田用种96.0%的种子质量标准要求。

参考文献：

[ 1 ] 罗黎明，刘丽，于丽娟，等.DNA分子标记技术在玉米种子纯度鉴定中的应用[J].生物技术进展，2011，1（1）：7-13.

[ 2 ] 刘子记，曹振木，杨衍.应用分子标记检测作物杂交种纯度研究现状及比較分析[J].长江蔬菜，2013（12）：10-15.

[ 3 ] 赵欣欣，于运国，崔克艳.玉米种子纯度室内检验方法的研究现状与应用展望[J].种子科技，2010，28（1）：24-27.

[ 4 ] 张体付，葛敏，韦玉才，等.玉米功能性Insertion/Deletion（InDel）分子标记的挖掘及其在杂交种纯度鉴定中的应用[J].玉米科学，2012，20（2）：64-68.

[ 5 ] 孔菲.SSR分子标记在玉米种子纯度鉴定中的应用[J].种子世界，2011（2）：33-34.

[ 6 ] 李英孜，陈皆辉.玉米蛋白质电泳法与田间种植鉴定法测定杂交种纯度相关性试验[J].内蒙古农业科技，1998（S1）：33-34.

[ 7 ] 张承毅，吴承来，张春庆.蛋白质电泳法鉴定大白菜种子纯度[J].山东农业科学，2007（3）：108-110.

[ 8 ] 孙加梅，王雪梅，王东建，等.谷子SSR标记研究进展[J].生物技术，2012，22（5）：86-89.

[ 9 ] 李苗，李新，甘晓燕，等.SSR标记对宁单11种子纯度的鉴定[J].种子，2010，29（9）：38-39，43.

[ 10 ] 刘宏魁，闫洪朗，原亚萍.应用盐溶蛋白电泳和SSR分子标记鉴定玉米种子纯度的研究[J].安徽农业科学，2011，39（19）：11396-11398.

[ 11 ] 李阳，范梦伟，季晓坤，等.利用SSR技术鉴定玉米杂交种“家佳荣2号”的种子纯度[J].西南农业学报，2018，31（7）：1349-1354.

[ 12 ] 吴明生，赵海艳，黄铃冰.利用SSR标记快速鉴定辣椒种子纯度[J].种子世界，2017（11）：13-15.

[ 13 ] 郭景伦，赵久然，尉德铭，等.玉米单粒种子DNA提取新方法[J].北京农业科学，1997（2）：2-3.

[ 14 ] 刘勤红，王芙蓉，张军，等.利用SSR标记鉴定鲁棉研15号杂交种纯度的研究[J].山东农业科学，2003（2）：7-9.

[ 15 ] 卢虹，徐爱遐.SSR分子标记技术在甘蓝型油菜杂交种陕油16纯度鉴定中的应用[J].种子，2016，35（6）：123-126.

[ 16 ] 李汝玉，李群，谭振馨，等.利用SSR标记鉴定玉米杂交种纯度技术规程[J].种子，2005（9）：54-56.

（收稿日期：2019-03-31）