浅谈不同甲酯化条件对牛乳中EPA、DHA含量测定影响

张加永 魏胜记 纪小兰

摘 要： DHA和EPA对人体有重要的生理功能。它能调节人体的脂质代谢，治疗和预防心脑血管疾病，促进生长发育。实验部分采用气相色谱法针对不同甲酯化条件下对牛乳中DHA和EPA进行测定研究，对甲酯化反应的时间、温度、KOH-甲醇溶液加入量和浓度设计正交试验，研究不同条件对牛乳中DHA和EPA测定的影响，最终确定甲酯化最佳条件，影响其甲酯化的因素依次为加入量>浓度>时间>温度。

关键词：DHA;甲酯化;气相色谱

1 实验材料与方法

1.1 仪器与试剂

电子分析天平（AL204，梅特勒）;气相色谱仪（GC-450，德国布鲁克）涡旋混合仪（IKA）旋转蒸发器（IKA）恒温水浴锅（上海一恒）

氨水（AR，天津福晨）;无水乙醇（AR，天津福晨）;乙醚氢氧化钾-甲醇（AR，天津福晨）;正己烷（HPLC，天津福晨）;石油醚（AR，天津福晨）;无水硫酸钠（AR，天津福晨）;EPA脂肪酸甲酯（上海安谱）;DHA脂肪酸甲酯（上海安谱）

1.2实验方法

1.2.1色谱条件

a） 毛细管柱：SP-2560或具有同等性能的柱子;b） 进样口温度，250℃;c） 分流比：20：1;进样量：1μl;d） 检测器温度：300℃;

d） 程序升温：初始温度为80℃;14℃/min升至175℃保持5min。然后以4℃/min升至210℃保持2min;再以2℃/min升至230℃;

1.2.2方法原理

利用氨—乙醇溶液破坏乳的胶体性状及脂肪球膜，使非脂成分溶解于氨—乙醇溶液中，再用乙醚—石油醚提取出脂肪。脂肪在室温下在正己烷中与甲醇-氢氧化钾反应快速酯化后进行气相色谱柱分析，氢火焰离子化检测器检测，以外标法定量。

1.2.3待测样品溶液的制备

准确称量10g于平底烧瓶，加2ml氨水轻摇，于65℃水浴回馏15分钟后，用10ml乙醇冲洗回馏管，冷却至室温。将样品加入250ml分液漏斗中。用25ml乙醚冲洗烧瓶后加入分液漏斗中，再用50ml石油醚分两次洗涤烧瓶后合并洗液，充分振摇。静置分层后，分离出水相再用5ml無水乙醇、15ml乙醚 、15ml石油醚重复提取。合并有机相后，用纯水洗涤有机相至中性，将有机相过无水硫酸钠，除去少量的残留水。在氮气保护下将样品浓缩近干。用正己烷冲洗浓缩瓶，定容至10ml，准确量取2ml提取液，加0.5ml无水甲醇—氢氧化钾充分振摇，静置酯化10分钟后，取上清液，过滤，进样。

2实验结果与讨论

2.1甲酯化最佳条件的确定

2.1.1 氢氧化钾‐甲醇溶液浓度的确定

选择浓度为1mol/L、2mol/L、3mol/L、4mol/L、5mol/L、6mol/L、7mol/L几个浓度点经过水解、提取、浓缩、甲酯化、定容，取2ml提取液，分别加0.5ml上述浓度氢氧化钾‐甲醇溶液，甲酯化10min后取上清液，过滤，经气相检测DHA、EPA含量当氢氧化钾-甲醇浓度到达4mol/L时，含量基本上趋于稳定，因此选择氢氧化钾-甲醇浓度为4mol/L。

2.1.2 氢氧化钾‐甲醇溶液加入量的确定

样品经处理后，分别加入4mol/L氢氧化钾‐甲醇溶液0.1ml、0.3ml、0.5ml、0.7ml、0.9ml经振揺静置10min后取上清液，过滤，经气相检测DH、EPA含量前阶段随DHA、EPA随着氢氧化钾-甲醇溶液加入量的增加而增加，当达到0.5ml时达到最大值，表明甲酯化进行完全，因此选用加入量为0.5ml。

2.1.3 甲酯化反应时间的确定

反应时间的长短直接决定甲酯化是否完全进行。经处理后的试样加入0.5ml的4mol/L氢氧化钾‐甲醇溶液振揺后分别静置6min、8min、10min、12min、14min后取上清液，过滤，经气相检测DHA、EPA可以看出实验静置时间对反应的影响较小，在反应进行10min已经基本上趋于稳定，因此选用反应时间为10min，当然在实际操作中可以适当延长一下。

2.1.4 甲酯化反应温度的确定

经处理后的试样分别加入0.5ml的4mol/L氢氧化钾‐甲醇溶液振揺后分别在10℃、15℃、20℃、25℃、30℃静置10min后取上清液，过滤，经气相检测DHA、EPA含量不难看出在一般的室温条件下都不会对结果造成太大的影响，满足实验室的分析要求。

2.2 正交试验的结果与分析

设计正交试验L9（34），研究脂肪被提取后与氢氧化钾-甲醇溶液发生甲酯化反应，考察氢氧化钾-甲醇浓度、加入量、反应时间、温度、对实验结果的影响，因看出四个因素对甲酯化的影响都不太显著。因素水平中最佳工艺条件为：氢氧化钾-甲醇浓度为4mol/L或5mol/L，加入量为0.5ml或0.6ml，温度20℃或25℃，时间为10min或12min，从试剂节约、快速分析及柱子的使用寿命等角度考虑选前者为最佳组合。

2.3 实验结果与结论

2.3.1实验结果

采用本检测方法，在原料中添加三个浓度水平（加标水平为0.2μg/mL、0.4μg/mL、4.0μg/mL）的两种混合标准物质（DHA;EPA）进行加标回收实验，结果样品的加标回收率在83.0-115.6%的范围内，在75%-125%回收率范围内，可以对样品进行定性定量处理。

2.3.2实验结论

（1）室温对甲酯化的影响不大，对实验的结果几乎没有影响，化验室的温度完全满足实验的需要，氢氧化钾-甲醇的浓度、加入量及静置时间对实验结果都有不同程度的影响，通过正交试验对四个因素分析影响的主次顺序为：加入量>浓度>时间>温度。

（2）通过对甲酯化条件单因素变量分析最终确定最佳反应条件为氢氧化钾-甲醇浓度为4mol/L，加入量为0.5ml，反应时间为10min，温度为20℃。

（3）通过加标验证，回收率比较高同时也说明此方法可行，满足实验室日常分析要求。

参考文献

[1] 唐芳， 李小元， 吴卫国， 等. 山茶油脂肪酸甲酯化条件研究[J]. 粮食 与油脂， 2010（8）： 36-39.

[2] 刘小如， 邓泽元， 范亚苇， 等. ICP-AES 测定苦瓜籽矿质元素及GCMS 鉴定其油脂脂肪酸[J]. 光谱学与光谱分析， 2010， 30（8）： 2265-2268.

[3] 赵雷， 刘国琴， 李琳. 超声波加速脂肪酸甲酯化的研究[J]. 中国油脂， 2008， 31（1）： 33-36.

[4] 佘珠花. 气相色谱法中油脂脂肪酸衍生化方法及其选择[J]. 粮食加 工， 2004（6）： 64-66.