高压电晕电场处理紫花苜蓿的生物效应

(内蒙古工业大学理学院，呼和浩特 010051)

高压电晕电场是指能产生局部电晕放电的非均匀电场。对于多针阵列电极，由于针尖曲率半径小，尖端电荷密度很大，当电压升高到一定值时，针尖处积累的大量电荷所产生的强电场使针尖周围的空气电离，从而产生局部放电，产生电晕[1-2]，这种装置更适用于生物效应和诱变机制研究。多针-板电极结构的高压电晕电场一般被应用于生物物料干燥及静电除尘[3-7]，还可用于环境污染物治理，降苯除硫[8]，以及农产品分级[9]。近年来，这一技术被拓展应运于生物诱变及转基因，发现电晕电场处理可提高愈伤组织诱导率和分化率，促进愈伤组织形成[10]。利用高压电晕电场诱变北虫草菌分生孢子，可得到与原始菌株拮抗线明显、电泳图谱有明显差异的诱变菌株[11]。可引发黄霉素产生菌、纳豆芽孢杆菌和出芽短梗霉菌突变，获得高效高产的突变菌[12-14]。利用高压电晕电场处理大肠杆菌发现，电晕电场对大肠杆菌的诱变具有损伤低、突变率高、突变谱宽的特点[15-16]。对棉花种子和小麦种子处理后发现，电晕放电形成的等离子体活性物质对种子表面有化学刻蚀和物理刻蚀作用，使种子表面脊状突起减薄，并产生2微米级的刻蚀裂纹，这些蚀刻效果提高了种子的渗透性和吸水能力，可能促进了小麦种子的萌发、幼苗生长以及一些生理和代谢活动[17-18]。研究表明，高压电晕电场是一种具有装置简单、生物效应明显、环境友好等很多优点的新型物理诱变技术。目前，国家专利局已正式授权该技术实用新型专利[19]。

紫花苜蓿是多年生豆科开花植物，它具有产量高、适应性强、草质优良(收割的干草粗蛋白含量常达20%以上)、易于家畜消化等特点，是养殖业首选青饲料，在畜牧业、农业耕作及生态环保等方面起着非常重要的作用[20]。但目前，天然草地的劣变导致饲草产量降低、品质下降，草畜失衡的矛盾日益加剧，严重制约了畜牧业可持续发展。为此诱变选育优良紫花苜蓿牧草种质资源是迫在眉睫的大事。而高压电晕电场对紫花苜蓿生物效应研究尚未见报道，利用高压电晕电场生物技术进行紫花苜蓿品种改良研究，培育有价值种质资源，选育出高抗、优质新苜蓿品种，将会创造良好社会和经济效益。

1 材料与方法

1.1 材 料

中国农业科学院草原研究所提供的紫花苜蓿种子。

1.2 仪器与设备

本实验采用的实验装置如图1所示。本实验中，高压电源输出频率为50 Hz，电压为0～50 kV连续可调正弦交流电。高压电极是由长2 cm，针横、纵向间距均为4 cm的针阵列组成，接地极为平面铝板。电极尖端到接地极之间的距离(极距)为4 cm。

注：A为超净工作台；B为电极系统；C为控制单元；D为高压绝缘卡；E为高压电源。图1 高压电晕电场诱变装置

1.3 试验方法

1.3.1样品准备

对紫花苜蓿进行选种，筛除不良籽粒，得到一致性较好的饱满籽粒198 g，蒸馏水冲洗3次去除表面杂质及浮土，均匀摆放在直径为9 cm培养皿内，每皿6 g，共33个培养皿，用万分之一电子天平进行精确称量并标记。

1.3.2高压电晕电场处理

采用电压为0(ck对照组)、4 kV、8 kV、12 kV、16 kV、19 kV针-板电晕电场分别对上述准备好的紫花苜蓿样品进行处理，处理时间为30 min，处理时每个剂量分成2组，每组3次重复，其中一组用厚度为1 mm的聚丙烯培养皿盖电介质阻挡放电，另一组不加培养皿盖。

1.3.3紫花苜蓿种子电导率的测定

在上述处理后的33个培养皿种子中同时加入去离子水40 mL，浸种20 h后用DDSJ-318型电导仪测浸出液电导率。

1.3.4紫花苜蓿种子吸水率的测定

上述浸种20 h后的紫花苜蓿吸胀种子用滤纸吸干表面水分后称量吸水后种子的质量。吸水率用如下公式计算。

吸水率(%)=[(吸水后种子质量-吸水前种子的质量)/吸水前种子的质量]×100%。

1.3.5苗高、鲜重的测量

从每个皿中随机挑取100粒种子摆放在铺有3层滤纸的培养皿中同置于光照培养箱中26 ℃恒温培养，3 d后统计发芽势、5 d后统计发芽率。在出芽后，给光照培养箱加140 lx光照条件，连续光照14 h，黑暗10 h进行培养，10 d后每皿随机挑取10株紫花苜蓿幼苗测量鲜重和苗高。

2 结果与分析

2.1 高压电晕电场处理对紫花苜蓿种子浸出液电导率的影响

经高压电晕电场处理后，紫花苜蓿种子浸出液电导率如图2所示。

图2 电导率变化

由图2可知，用电压为4 kV、8 kV、16 kV、20 kV高压电晕电场处理30 min后无论是否用培养皿盖阻挡放电，紫花苜蓿种子浸出液的电导率较对照组都有一定提高，电压为4 kV、8 kV、16 kV时，未经培养皿盖阻挡放电的种子浸出液的电导率均高于培养皿盖阻挡后的电导率。电压为20 kV时，经培养皿盖阻挡放电后的种子浸出液的电导率高于未阻挡的电导率。经电压为12 kV的高压电晕电场处理后，无论培养皿盖阻挡与否，紫花苜蓿种子浸出液的电导率较对照组都低。从变化趋势看，紫花苜蓿种子浸出液的电导率随电压升高呈先升后降再升再降的非单调震荡型曲线。

2.2 高压电晕电场处理对紫花苜蓿种子吸水率的影响

经高压电晕电场处理后，紫花苜蓿种子吸水率如图3所示。由图3(a)可知，8 kV加盖阻挡组和16 kV不阻挡组，种子的吸水率比对照有所下降，但下降不明显，其他各组的种子吸水率与对照组相比都有所升高。这说明，经高压电晕电场处理后，可改善种子的吸水率。在实验中还发现，当各组种子电晕电场处理后，浸种时在培养皿中加入40 mL去离子水，电场处理时不加盖阻挡的种子只有很少几粒漂浮在水面，加盖阻挡时，漂浮在水面的种子有所增加，但不足6 g种子的1/3，而对照组的种子则有一多半漂浮在水面上。图3(b)所示照片左为对照组(0 kV)，中为19 kV加培养皿盖阻挡放电组，右为19 kV不加培养皿盖组。其它场强的电晕电场处理组也发现类似情况。

图3(a)吸水率变化

图3(b)种子浸泡

2.3 高压电晕电场处理对紫花苜蓿种子发芽势及发芽率的影响

经高压电晕电场处理后，紫花苜蓿种子发芽势和发芽率分别如图4、图5所示。由图可知，在高压电晕电场处理时，有没有培养皿盖阻挡放电对紫花苜蓿种子的发芽势和发芽率有截然相反的影响。当没有培养皿盖阻挡放电时，在低剂量即电压为4 kV、8 kV时，高压电晕电场处理对紫花苜蓿种子的发芽有刺激效应，而经培养皿盖阻挡放电后，高压电晕电场处理对紫花苜蓿种子的发芽却为抑制效应。随着电压进一步升高，当没有培养皿盖阻挡放电时，高压电晕电场对紫花苜蓿种子的发芽全部表现为抑制效应，并随电压升高，抑制效应越明显；而经培养皿盖阻挡放电后，高压电晕电场处理对紫花苜蓿种子的发芽却变为刺激效应，只有在16 kV时是抑制效应。经培养皿盖阻挡放电后，紫花苜蓿种子的发芽势和发芽率整体呈典型的均匀电场生物效应曲线即非单调震荡型曲线。

2.4 高压电晕电场处理对紫花苜蓿苗高和鲜重的影响

经高压电晕电场处理后，紫花苜蓿苗高和鲜重如图6、图7所示。从图6可以看出，高压电晕电场处理后，紫花苜蓿的苗高与对照相比都有大幅度提高，总体呈先升后降趋势，低剂量处理无论是否有介质阻挡放电，对苗高影响较大，随着剂量升高，苗高有一定降低，但均大幅度高于对照。从图7可知，除4 kV加培养皿盖阻挡放电组和12 kV无阻挡组的鲜重低于对照组外，其余各处理组的鲜重与对照组相比都有一定提高。鲜重的变化趋势与发芽势发芽率的变化趋势基本相同。

图4 发芽势变化

图5 发芽率变化

图6 苗高变化

图7 鲜重变化

3 讨 论

由气体放电理论可知，当高压电晕电场处理紫花苜蓿种子时，加培养皿盖阻挡放电，可导致种子接受的总场强迅速减小。电场强度的减小导致微放电的减少和击穿电压升高[21]。且实验发现，介质阻挡层可以有效地降低电场的非均匀度[22]。总之，在高压电晕电场处理紫花苜蓿种子时，加培养皿盖阻挡放电，可以非常有效的减小离子风对的物理刻蚀程度，同时降低紫花苜蓿种子的接受的场强，并使紫花苜蓿种子接受的辐射电场更趋均匀，等离子体活性物质的浓度更小使化学刻蚀紫花苜蓿种子程度减弱。

非均匀电场对处在其中的生物体有一系列作用[23]，如可对生物膜产生影响，改变酶活性，促进愈伤组织增殖分化，影响光合器官和功能等。高压电晕电场的另一个作用就是非均匀电晕放电，电晕放电可以使空气电离产生较多低温等离子体，并在电场作用下形成离子风，特别是同时产生的化学物质，包括活性氧(ROS)和活性氮(RNS)，具有较高的催化活性和生物效应[24-25]，而且电晕放电还可产生水煤气、CO2、CO和含有-C(CH3)3-部分的分子，可能通过氧化种皮的有机组分对种子表面形成化学刻蚀[17]，这种物理和化学刻蚀可使紫花苜蓿种子表皮减薄，并产生刻蚀裂纹。

紫花苜蓿种子表面是疏水的，由浸种实验图3(b)可以看出，未经处理的对照组种子更多漂浮在水面上。高压电晕电场处理后，种皮的高度致密的表面纹理也可能更脆弱，因此更容易开裂，这有利于更有效吸收水和营养物[26]，种子表面的物理化学刻蚀使其更亲水，这有利于种子润湿和渗透到种子中从而促进发芽过程[27]。种子的亲水性可以通过吸水率测量来证实。本实验中，只有8 kV加盖阻挡组种子的吸水率比对照有所下降，但下降不明显，是否是刻蚀程度不足，还需进一步研究。其他各处理组的种子吸水率与对照组相比都有所升高。在图3(b)中可以看到，大部分未经处理(对照组ck)的种子漂浮在水面上，而高压电晕电场处理的种子由于不同的吸水能力而下沉到培养皿的底部。本研究结果与Wang等[17]的结果一致。电晕放电等离子体物理化学刻蚀，可使种皮减薄并产生裂纹，提高吸水率的同时，也增加了种子中电解液的外渗。从图2中可以看出，除12 kV的高压电晕电场处理组外，其他4组无论是否有培养皿盖阻挡放电，其浸出液的电导率都较对照组高。从图4、图5、图7的发芽势、发芽率和鲜重结果可知，当没有培养皿阻挡放电，在低剂量4 kV和8 kV时，高压电晕电场处理对紫花苜蓿的发芽有刺激效应，促进紫花苜蓿生长。当电压继续增大时，发芽表现为抑制效应，也对紫花苜蓿的生长量有一定抑制。许潇等发现，当极距为d=30 mm时，多针电极起晕电压<6 kV，多针电极的击穿电压出现在19 kV左右[28]。本实验设定的极距为d=40 mm，实验中发现，击穿电压为19 kV，起晕电压约为6 kV。这说明，4 kV和8 kV在产生电晕放电的临界电压附近，此时，等离子体浓度较低，电压小，等离子体加速后能量也很小，对种子的物理化学刻蚀适当，所以，此剂量下对发芽率有刺激效应。随着电压升高，场强增加，放电等离子体浓度增大，离子风速度加大，对紫花苜蓿种子的物理化学刻蚀程度加深，多种因素相加对紫花苜蓿的损伤程度加大，进而转化为对发芽抑制效应。对于加培养皿盖阻挡放电组来说，在高电压时，为刺激效应，主要原因是培养皿盖阻挡放电作用使起晕电压和击穿电压升高，且非常有效的减小离子风对种子的物理刻蚀程度，同时降低紫花苜蓿种子的接受的场强，并使紫花苜蓿种子接受的辐射电场更趋均匀，等离子体活性物质的浓度更小使化学刻蚀紫花苜蓿种子程度减弱。介质阻挡作用使高电压下这几种因素叠加后对紫花苜蓿的作用适当，所以发芽表现为刺激效应，促进了紫花苜蓿的生长。

有无培养皿盖阻挡放电对紫花苜蓿种子的发芽势和发芽率有截然相反的影响，整个变化趋势呈非单调震荡型曲线。考虑可能是由于细胞受到不同的高压非均匀电场的刺激后损伤修复程度不同，其中高压电场的电穿孔损伤作用不可忽视。当外加高压电场后，细胞膜各点受到电场力的作用，细胞膜上的分子或离子就会发生碰撞、吸引、排斥等一系列运动，加之离子风的物理化学刻蚀，导致细胞膜上出现孔洞，细胞电穿孔使膜内分子间相互作用力的平衡遭到破坏。白爱枝等研究表明，经高压电场处理后，细胞的形态发生了明显变化，细胞膜和细胞壁损伤严重，细胞内容物溢出[29]。当电压达到一定强度时会对发芽产生抑制作用，而高压电晕电场处理对种皮有刻蚀作用会促进发芽过程，与高压非均匀电场其他效应共同作用使得种子萌发分别呈刺激或抑制作用，另外此过程中伴随着种子的自我损伤修复过程，导致整个变化趋势呈非单调震荡型曲线。

从图6可知高压电晕电场处理后，紫花苜蓿的苗高与对照相比都有大幅度提高，说明高压电晕电场处理，无论是否抑制其吸水率或发芽率，均对已萌发的幼苗苗高有促进作用。是因为一定强度的电场处理可使自由基含量提高，从而使生物膜透性增加，酶活性增强，进而使种子提早萌发，生长加快[30]。种子萌发是一个复杂的过程，受多因素调控，其生理活动过程离不开酶的参与[31]。研究表明，电场处理可提高酶活性，促进种子的呼吸作用，为种子萌发提供必要的物质和能量保障，加速新细胞形成，促进根芽分化和生长，这也是种子在电场处理后萌发活力提高的内在原因[32-35]。前人研究认为，酶活性的增强与电场处理诱导酶的合成有关，其机制可能是电场作用引起蛋白质、糖、脂质等极性分子和离子的定向排列，从而引起含金属离子酶的构象发生变化，对酶提前进行激活作用[33-34,36]，进而对高压电场处理后的幼苗生长产生了促进作用。

4 结 论

1)高压电晕电场处理紫花苜蓿种子时，无论是否有培养皿盖阻挡放电，可改善紫花苜蓿种子的亲水性，使种子吸水后沉入培养皿底部，无培养皿盖阻挡放电组改善程度更大，只有8 kV加盖阻挡组种子的吸水率比对照有所下降。

2)在高压电晕电场处理紫花苜蓿种子时，加培养皿盖阻挡放电，可以非常有效的减小离子风对种子的物理刻蚀程度，同时降低紫花苜蓿种子的接受的场强，并使紫花苜蓿种子接受的辐射电场更趋均匀，等离子体活性物质的浓度更小，使化学刻蚀紫花苜蓿种子程度减弱。